监测长期增殖试验中的pH值

利用Cytation 5细胞成像多模式阅读器在成像的同时监测细胞培养状态

作者: Paul Held，博士，BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT . USA应用部门实验室经理

摘要

用于体外组织培养繁殖的培养基配方通常含有pH指示剂苯酚红。我们以前已经证明，酚红吸收可以用来测定细胞培养物的pH值。这里我们描述一下的用法2022世界杯南美区预选赛 细胞成像多模式阅读器通过吸收度测量监测培养基pH值，在多日基于图像的细胞增殖试验中。

简介

细胞增殖特性是生物研究和治疗药物开发的一个重要方面。目前大多数细胞增殖检测依赖于间接生化指标，受到人工制品或基于图像的终点测量的限制。例如，DNA合成可以通过合并胸腺嘧啶类似物如BrdU, EdU和IdU进行评估。然后用特定的抗体或化学物质检测这些类似物。细胞代谢可以用四唑盐进行评估，四唑盐在细胞酶的作用下转化为有色化合物。几种不同的增殖标志蛋白，如PCNA、ki67和MCM-2可以通过免疫荧光检测到。虽然这些技术可以提供细胞生长的快照，但它们不能提供有关长期增殖的信息。

长期细胞体外增殖试验已被证明在抗增殖药物的测试方面是非常有用的^[1]．

这些测定在组织培养基配方中进行数天，目的是模拟正常供应的营养物质在活的有机体内．

图1．康宁®细胞培养烧瓶含有酚红培养基。

大多数哺乳动物组织的ph值接近中性。通过正常的身体呼吸调节碳酸氢盐缓冲系统，人类动脉血液的ph值维持在7.4(7.35-7.45)。偏离正常范围可诱导机体增加或减少肺活动，以改变CO₂过期^[２]．在相同的pH值水平下，细胞和组织的体外培养也能顺利进行，这并不奇怪。培养维持在生理pH值主要与碳酸氢盐缓冲系统以及。碳酸氢盐,有限公司₂该系统使用与二氧化碳气体浓度相匹配的溶解碳酸氢盐。二氧化碳与水发生反应时溶解在介质中形成碳酸。碳酸和碳酸氢盐也相互作用形成平衡，能够保持pH值在生理水平。

不论使用何种缓冲剂，组织培养基中通常添加酚红染料。而酚红则被描述为在某些条件下的弱雌激素^[3]在大多数情况下，它是一种惰性化合物，添加到体外培养基中作为可视的pH值指示器。虽然浓度因不同的培养基配方而不同，但当它出现时，通常在5- 15mg /L范围内。

细胞死亡或污乐鱼平台入口染物过度生长产生的废物会导致pH值下降，导致指示物颜色的改变。例如，一个分裂相对缓慢的哺乳动物细胞培养物的污染可能会迅速被细菌过度生长，导致培养基酸化，指示物变黄。哺乳动物细胞废物本身会慢慢降低pH值，逐渐乐鱼平台入口使溶液变成橙色，然后变成黄色。这种颜色的变化表明，即使没有污染，介质也需要更换。

活细胞成像实验完全聚焦于手边的生物学。无论图像是亮场、相位对比还是荧光，媒体的背景环境都没有被观察到，通常被忽略。在这里，我们描述了使用Cytation™5细胞成像多模式阅读器来监测细胞培养的pH值状态，同时捕获数字显微图像。这利用阅读器的独特功能，结合细胞成像测量良好的吸光度。

材料与方法

DMEM、胎牛血清(FBS)和青霉素-谷氨酰胺采购自Life Technologies。透明底部，黑色边96孔微板(3904)来自康宁。

活细胞实验

表达核H2B-GFP嵌合荧光蛋白的HCT116-GFP结肠癌细胞在添加10%胎牛血清和青霉素-链霉素的高级DMEM中培养，37℃，5% CO₂．培养物在80%汇合时常规胰酶(0.05%胰蛋白酶- EDTA)。在实验中，细胞被镀到康宁3904黑边透明底96孔微板上。长期生长测量使用BioSpa™8自动培养箱(BioTek Instruments Winooski, VT)与Cytation™5细胞成像多模式阅读器(BioTek Instruments)接口。BioSpa系统控制阅读器调度，并在潮湿的受控环境(37°C, 5% CO)中维护细胞₂)在成像和板吸光度测量之间。根据需要，BioSpa将一个微板运输到Cytation 5进行成像和吸光度测量，然后将其返回培养箱。HCT116-GFP细胞以每孔500或2000细胞的数量接种。在开始生长测量前，细胞被放置一夜。使用配置了GFP光立方的Cytation 5细胞成像多模式阅读器对HCT116- GFP细胞进行成像。成像仪保持37°C和5% CO₂并使用LED光源结合带通滤波器和二色镜来提供适当波长的光。GFP光立方由469/35激励滤波器和525/39发射滤波器组成，用于表达GFP的成像细胞。蒙太奇(2 × 2)数字图像使用4倍物镜制作，并使用Gen5 Microplate Reader和Imager Software (BioTek Instruments)缝合到单个文件。对捕获的数字图像进行初级掩模分析，以确定细胞数量。核被鉴定为尺寸在5-100 μm之间的荧光物体，荧光超过1500阈值。成像后立即使用Cytation 5的UV-Vis单色仪模块测量560 nm处的吸光度。

结果

在细胞核中表达GFP的活HCT116细胞通过图像分析很容易计数。绿色荧光可以识别每个细胞，而不需要影响细胞生长的核酸结合染色剂。当HCT116-GFP细胞以低密度播种并监测5天的过程时，通过插值之前确定的pH校准曲线，使用560吸光度计算每个孔的pH值。这些培养物的pH值在5天内只下降了0.15左右，尽管计数的细胞数量增加了50倍(图2)。

图2．非融合培养中HCT116细胞计数和pH值随时间的变化HCT116细胞以每孔500个细胞的密度进行播种。24小时后，允许附着，每2小时对96孔板培养物进行基于图像和吸光度分析，持续5天，并绘制结果。pH值是通过插值之前生成的校准曲线的数据来确定的。数据表示在每个数据点上96次测定的平均值和扫描电镜。

在这些实验中，细胞的播种密度是在5天结束时还没有达到融合(图3)。在这种状态下，细胞不受接触抑制，可以自由分裂。唯一的限制是培养基的营养和pH值状态。

图3。HCT116-GFP细胞培养5天的蒙太奇图像。HCT116-GFP细胞以每孔500个细胞的速度接种到96孔板上，并放置24小时。使用GFP LED立方体，每24小时用4倍物镜制作蒙太奇图像(2 × 2)。

细胞数与415/560吸光度比的比较证实了这一点。这个比例是介质颜色的函数，我们在前面已经证明它与pH成反比^[4]．如图4所示，在这些细胞培养中，细胞数量随着时间的增加而增加。在这些条件下，细胞能够不受阻碍地生长和分裂，随着时间的推移，确定的细胞数量增加。由于细胞物理位置的不同，以及初始细胞数量的不同，单个井细胞数量可能会有所不同。因为用于细胞计数的缝合图像只包含了阱的中心部分，所以附着在阱周边的细胞不一定会被计数。同样地，在最初播种时接收到的细胞数量略多或略少的井，在以后的时间间隔中也会有不同的细胞计数。尽管细胞数量变化多端，但细胞数量随时间呈线性增长。随着时间的推移和细胞数量的增加，井的pH值会降低。

图4。低细胞密度播种培养基颜色与细胞数的关系。在培养5天的时间内，96孔板每孔的细胞计数与415/560吸光度比绘制。每个数据点代表一口井。

当HCT116-GFP细胞以较高的密度播种时，pH值的变化成为一个更大的问题，细胞数量的增加最终停滞(图5)。当细胞以每孔2000个细胞的密度播种时，细胞数量的增加导致pH值下降约为较低播种密度的2倍。尽管细胞数量在大约80小时后停滞，但pH值的下降持续了实验的时间。在较高的细胞密度下，细胞继续呼吸，尽管细胞数量停止增加，导致pH值下降。

图5。融合培养中HCT116细胞计数和pH值随时间的变化HCT116细胞以每孔2000个细胞的密度进行播种。24小时后，考虑到附着，96孔板培养每2小时进行一次基于图像的吸收分析，持续5天。pH值是通过插值415/560的比值值与之前生成的校准曲线来确定的。数据表示在每个数据点上96次测定的平均值和扫描电镜。

细胞融合可以在图5中看到，在96小时和120小时之间观察到的荧光几乎没有增加。

图6。HCT116-GFP细胞培养5天的蒙太奇图像。HCT116-GFP细胞以每孔2000个细胞的速度接种到96孔板上，并放置24小时。使用GFP LED立方体，每24小时用4倍物镜制作蒙太奇图像(2 × 2)。

在长期培养中，细胞融合对生长的抑制可以通过细胞计数来确定。如图7所示，从基于细胞核计数的图像中确定的细胞数量，不再随着时间的推移而增加，因为细胞变得融合。细胞数量在4或5天后没有明显增加。然而，通过415/560吸光度比的增加可以观察到介质的pH值确实降低了。尽管细胞数量很少或没有增加，废物继续被排出，营养物质被存在的细胞消耗。乐鱼平台入口

图7。高密度播种培养基颜色与细胞数的关系。在培养5天的时间内，96孔板每孔的细胞计数与415/560吸光度比绘制。每个数据点代表一口井。

讨论

这些数据表明，cyation™5细胞成像多模式阅读器能够监测活细胞实验中的细胞培养pH值，同时进行成像。由于细胞数量和细胞呼吸的增加，细胞培养物通常会变成酸性，导致含有酚红的培养基配方颜色变黄。虽然在短期实验中pH值的变化通常可以忽略不计，但在长期活细胞实验中，随着细胞数量的增加和持续时间的延长，培养基配方的缓冲能力可能会被淹没。实时监测培养pH值变化的能力可以使研究人员对观察到的实验结果有信心，或中止有有害pH条件的实验。

随着时间的推移，监测细胞数量或细胞合并是一种常用来测试抗肿瘤药物在阻止细胞生长方面的功效。使用酚红吸光度来监测培养基pH值，确保报告的抑制是测试化合物的结果，而不是糟糕的组织培养基状态。

Cytation 5是活体细胞成像实验中监测苯酚红吸光度变化的理想平台。该阅读器的独特之处在于，它具有使用专用UV-Vis单色仪进行吸光度测量和使用6位物镜转塔和LED光立方进行显微成像的能力。快速的吸光度读数只增加了几秒钟的完整96孔成像步骤，但可以提供关于细胞培养状态的有效信息。Gen5™Microplate Reader and Imager软件，除了控制阅读器功能外，还可用于根据之前建立的pH校准曲线计算pH值。这种独特的组合可以持续实时监测长期活细胞培养实验。

参考文献

1. Clayton, J(2017)使用无标签细胞计数的动力学增殖试验，BioTek仪器应用说明。//www.aspinnursery.com/2022卡塔尔世界杯完整赛程resources/ application-notes/ kinetics -增殖-分析-using-labelfree细胞计数/
2. 罗德尼·罗迪斯(Rodney A. Rhoades);大卫·R.贝尔(2012)。临床医学医学生理学原理(第四版，国际版)。费城,宾夕法尼亚州。:利平科特·威廉姆斯和威尔金斯。ISBN 9781451110395。
3. Berthois y;卡泽伦伯根;Katzenellenbogen, b.s.(1986)。“组织培养基中的酚红是一种弱雌激素:对培养中雌激素反应细胞研究的启示”(pdf)。美国国家科学院院刊，83(8):2946- 2500。PMC 323325。PMID 3458212。doi: 10.1073 / pnas.83.8.2496。
4. Held, P.(2018)使用酚红评估组织培养基的pH值。应用程序的注意。BioTek Instruments, www.aspinnursery.com

AN081920_09