使用无标记细胞计数的动态增殖试验

作者: Joe Clayton，博士，BioTek Instruments首席科学家


电影1:NIH3T3用0.1µM阿霉素处理
电影2:NIH3T3用载体处理

摘要

动态细胞增殖试验能够定量分析细胞活力和生长速率，是评估细胞对药物治疗反应的有力工具。传统方法依赖于间接生化测量或使用荧光标记。另外，高对比度亮场细胞计数提供了一种直接和无标记的方法来测量细胞群大小。结合高对比度的亮场成像能力Cytation™5细胞成像多模式阅读器与BioSpa™8自动化培养箱可以方便和强大的长期动力学细胞增殖研究。

简介

细胞增殖特性是生物学研究和治疗药物开发的一个重要方面。目前大多数细胞增殖测定依赖于间接生化指标，受人工制品或基于成像的终点测量的限制。在这里，我们描述了使用BioSpa™8自动化培养箱和Cytation™5细胞成像多模式阅读器以及高对比度Brightfield试剂盒来确定细胞增殖谱的连续活细胞分析。这种全自动方法能够使用无标记的直接细胞计数对细胞生长进行准确的定量和表型长期分析^[1]．

高对比度Brightfield试剂盒使每个细胞的光折射产生一个亮点，无需核染色即可进行准确的细胞计数(图1)。高对比度Brightfield细胞计数与使用核染料(如Hoechst和DAPI)实现的计数相当(图2)，同时可以进行长期增殖研究^[２]．

图1所示。高对比度亮场直接细胞计数。(A) NIH3T3细胞聚焦图像。(B)离焦图像产生一个单独的亮点对应于每个细胞。(C) Gen 5对象掩蔽工具可以很容易地识别每个亮点，以生成细胞计数。

图2。高对比度无亮场标记细胞计数与Hoechst标记细胞核计数的比较。在较宽的播种密度范围内，两种技术对NIH3T3细胞Hoechst染色的细胞计数具有高度可比性。点拟合到一个非线性回归方程，R2值为0.99，斜率为0.97。

NIH3T3、HCT116和HeLa细胞生长监测5天。所有三种细胞类型均表现出稳健的对数生长直至完全融合。为了证明该系统筛选药物的能力，生成了用两种抗癌药物的8种浓度培养的细胞增殖谱。浓度-响应曲线和IC₅₀数值用于量化每种细胞类型的抗增殖效果。

材料与方法

细胞培养

NIH3T3和HeLa细胞在高级Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY)中与10% FBS (Gibco)和1x PenStrep-Glutamine (Cellgro, Manassas, VA)中培养。HCT116细胞在McCoys 5A培养基(Gibco)中添加10% FBS和1x PenStrep-Glutamine。细胞以每孔2000个细胞的速度被播种到黑边透明底部96孔微孔板(Corning, Corning, NY)。环境条件，包括温度(37°C)，气体(5% CO₂)和湿度(90%)由BioSpa™8自动化培养箱(BioTek Instruments, Winooski, VT)在五天的培养过程中保持。

细胞成像

细胞培养板每两小时由BioSpa 8转移到Cytation™5细胞成像多模式阅读器(BioTek Instruments, Winooski, VT)。环境条件保持在37ºC和5% CO₂在整个成像步骤的细胞5内。在每个时间点捕获两张高对比度的亮场图像:一张用于参考的焦内图像，一张用于细胞计数的散焦图像^[3]．简单地说，使用高对比度Brightfield试剂盒对细胞进行聚焦，并记录“聚焦中”焦距。然后使用视图线轮廓工具绘制一条线，该线穿过细胞和成像场的背景部分，没有细胞存在。然后，在观察线轮廓的同时降低焦距，以确定在达到最大的细胞和背景亮度对比度的焦距。

图像分析

图像预处理用于获得最佳的对比度增强，将每个细胞减少为单个亮点。然后设置对象屏蔽阈值，以识别每个细胞进行计数(表1)。

表1。Gen 5图像分析软件设置。图像预处理提高了对比度，减少了背景。细胞分析参数和高级分析参数的设置，以优化识别每个细胞准确的细胞计数。

结果

用无标记直接细胞计数定量评价细胞增殖

无标签的方法测量细胞生长动力学优于使用染色剂，可以影响增殖率。虽然汇流水平可用于某些应用，细胞计数是在广泛的细胞种群密度范围内细胞增殖的最直接定量测量(图3)。

图3。高对比度亮场细胞计数随时间相对汇合点。NIH3T3直接细胞计数和百分比合流随时间的比较显示了两种细胞生长指标的不同特征。标记游离细胞计数表明稳健的对数细胞生长到完全汇合(虚线)。

比较三种细胞类型的细胞增殖谱

NIH3T3, HeLa和HCT116细胞以低密度播种，并在BioSpa 8中培养5天。使用高对比度亮场细胞计数来定义每种细胞类型的增殖谱(图4)。在这些条件下，所有细胞都表现出稳健的对数生长，直到完全融合。

图4。NIH3T3, HeLa和HCT116的无标签直接细胞计数谱。细胞每2小时成像一次，培养生长监测5天或直到细胞计数稳定。

抗增殖化合物对细胞生长速率影响的测定

动力学细胞增殖研究使癌症治疗的定量评估成为可能。阿霉素是一种蒽环类抗肿瘤抗生素，通过插入DNA和抑制大分子生物合成来中断细胞分裂^(4、5)．它通常用于治疗多种癌症^[4]．Cercosporamide是一种mapk相互作用激酶(Mnk)，是翻译起始因子4E (elF4E)的有效选择性抑制剂。^[6]．最近的研究报道了尾孢酰胺抑制恶性肿瘤的生长，包括HCT116结肠癌异种移植瘤^(6、7)．为了探索阿霉素和尾孢酰胺对NIH3T3、HeLa和HCT116增殖的影响，在96孔模式下用8种药物浓度处理细胞，并监测5天(图5)。细胞增殖动力学曲线显示了三种细胞类型对阿霉素和尾孢酰胺的不同反应(图6)。NIH3T3细胞在任何测试浓度下都不受尾孢酰胺的影响。10 μM尾孢酰胺可抑制HeLa和HCT116两种癌细胞的增殖。阿霉素治疗可导致NIH3T3、HeLa和HCT116细胞增殖的剂量依赖性抑制。通过使用每个增殖轮廓的曲线下面积(AUC)确定IC50值，对阿霉素治疗随时间的影响进行定量分析(图7)。HCT116对阿霉素的敏感性最高，其次是HeLa和NIH3T3, IC50值分别为4 nM、5.1 nM和20.5 nM。

图5．96孔微孔板基质HeLa细胞增殖5天。将8个浓度的阿霉素和尾孢酰胺(各4个重复)与阴性对照一起进行测试。

图6。NIH3T3, HeLa和HCT116细胞增殖谱可以定量分析药物反应。每毫米的细胞数²每2小时计算一次，持续5天或直到细胞达到完全汇合。5种药物浓度的谱显示细胞类型依赖的差异剂量反应。

图7．测定阿霉素对细胞增殖的剂量依赖性抑制作用。每毫米细胞计数的AUC²使用增殖谱计算IC50值。

抗增殖药物对细胞反应的动力学表型分析

为了进一步检验阿霉素治疗的效果，使用实验视频(视频1、视频2)对每种细胞类型在药物抑制浓度下进行定性评价。10 nM阿霉素作用36h后，NIH3T3细胞数量明显减少，但未见明显凋亡迹象。这些发现表明，在这个浓度阿霉素抑制细胞分裂而不引起明显的细胞毒性。相比之下，1 μM阿霉素处理NIH3T3细胞在24小时内表现出相当大的细胞毒性和凋亡迹象(图8)。

图8．定性分析动力学细胞增殖提供了有价值的见解表型反应药物治疗。用指定浓度的阿霉素治疗36小时后NIH3T3增殖图像。在10nm时，阿霉素可抑制细胞分裂而不引起明显的细胞毒性。在100 nM及更高浓度时，细胞毒性迹象明显。

结论

BioSpa™8的细胞处理能力与Cytation™5的成像能力相结合，提供了一个完全自动化的系统，可以进行准确和可重复的长期增殖研究。高对比度亮场细胞计数可以定量分析细胞生长，而不需要破坏性标签。除了定量测量外，该系统还可用于随着时间的推移对细胞表型进行定性分析，以进一步表征药物治疗反应或进行靶向基因破坏研究。增殖试验可在96或384孔微孔板中进行，用于中高通量筛选。BioSpa 8和Cytation 5，以及强大的Gen™5图像分析工具，为广泛的动力学细胞增殖应用提供了一个优雅而强大的解决方案。

参考文献

1. Drey, l.l.， M.C. Graber和J. Bieschke，用改良的亮场显微镜计数未染色的融合细胞。生物学技术,2013年。55(1): p. 28-33。
2. Paul Held, j.c.， Peter Banks，高对比度Brightfield:启用基于微板的自动无标签细胞计数BioTek资源，2016。2022卡塔尔世界杯完整赛程
3. Joe Clayton, p.b.，使用高对比度Brightfield的无标签细胞计数指南。BioTek 2022卡塔尔世界杯完整赛程Resources 2016。
4. 塔卡尔，O.， P. Sriamornsak，和C.R. Dass，阿霉素:抗癌分子作用、毒性和新型给药系统的最新进展。《J Pharm Pharmacol》，2013。65(2): p. 157-70。
5. Fornari, f.a.，等，阿霉素对MCF-7乳腺肿瘤细胞DNA解开的干扰。Mol Pharmacol, 1994。45(4): p. 649-56。
6. Konicek, b.w.等，MAP激酶相互作用激酶阻断真核起始因子4E磷酸化并抑制实验性肺转移的生长。癌症研究，2011。71(5): p. 1849-57。
7. 阿尔特曼，j.k.等，尾孢酰胺对Mnk激酶活性的抑制和对急性髓系白血病前体的抑制作用。血,2013。121(18): p. 3675- 81。

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