384孔格式细胞增殖的自动动力学成像分析

基于图像的细胞增殖和死亡机制动力学分析

作者: Rebecca Mongeon，博士，安捷伦科技公司

摘要

逃避细胞死亡是癌细胞的一个标志，这使它们能够克服癌症发展的内源性障碍，并抵抗治疗。了解癌细胞是如何逃避细胞死亡的有望为治疗人类癌症开辟新的途径。在这里，我们提出了一种全自动的基于图像的检测，以高通量的方式监测纤维肉瘤癌细胞系对多种抗肿瘤药物的反应的增殖和细胞死亡。

简介

即使从生命开始，所有多细胞生物的正常功能都依赖于细胞死亡。处理不当的细胞死亡是从发育异常到癌症等各种现象的基础。对于癌症治疗来说，癌细胞逃避调节细胞死亡或凋亡的能力尤其成问题¹．无论通过放疗、免疫疗法还是化疗，癌症治疗的目标都是选择性地杀死癌细胞。了解细胞死亡的许多方面，特别是癌细胞能够克服的那些方面，是临床医生、初级研究人员和药物发现工作同样感兴趣的活跃领域¹．基于成像的监测细胞经历不同细胞死亡机制的工具提供了一种连续、实时、高通量地探测细胞死亡的手段。

调节细胞死亡，如凋亡，和意外细胞死亡，如坏死，这两个过程都可以发生在细胞应激源(即细胞应激源)的反应中。营养缺乏或DNA损伤)，但每种都会产生不同的标志性细胞变化²．当磷脂酰丝氨酸这种通常只存在于细胞膜内小叶的膜成分转移到细胞膜外小叶时，发生了早期状态凋亡的特征之一。磷脂酰丝氨酸的暴露可能促使吞噬细胞吞噬细胞或剩余的细胞碎片^3.．在这里，我们通过pSIVA-IANBD荧光探针的特异性结合和激活，光学监测活细胞中的磷脂酰丝氨酸暴露。这种荧光探针提供了细胞凋亡和持续到细胞死亡的活的动态指示器⁴．

细胞凋亡和坏死过程的一个特征变化是细胞膜完整性的丧失²．这种完整性的丧失使得通常被排除在外的分子可以进入细胞核，例如DNA染色染料碘化丙啶(PI)。因此，细胞核的荧光PI染色也可以作为细胞坏死和晚期凋亡过程的实时监测指标。

这项研究结合了长期动态无标签细胞计数和荧光成像，在高通量384孔基于图像的分析中监测癌细胞反应数天。安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek2022世界杯南美区预选赛 单元成像多模式阅读器具有宽视场摄像头，可在单张图像中捕获整个384口井。将Cytation 5与安捷伦BioTek结合2022世界杯附加赛决赛BioSpa 8全自动环境控制的自动化孵化器实现了高通量基于图像的细胞分析的即时工作流。

材料与方法

试剂

HT-1080纤维肉瘤细胞来自ATCC (Manassas, VA)。先进的DMEM、荧光DMEM、胎牛血清(FBS)和谷氨酰胺/青霉素/链霉素从赛默飞世尔科学公司(Waltham, MA)购买。staaurosporine, nocodazole，尼日尔菌素和喜树碱购自Tocris Bioscience (Minneapolis, MN)。显微镜动力学凋亡试剂盒(ab129817)购自Abcam (Cambridge, MA)。Greiner 384孔微板(零件号781091)来自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。

细胞培养和测定制备

HT-1080细胞在添加10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺和青霉素/链霉素的高级DMEM培养基中，在37°C加5% CO的潮湿培养箱中培养₂．细胞常规传代成功率为80%。在384孔微板中播种时，收获HT-1080细胞，并以每孔500个细胞的密度添加悬液。细胞粘附后(约4小时)，培养基更换为氟briite DMEM培养基。将动力学凋亡试剂盒试剂添加到每孔中，最终浓度为1µL/mL pSIVA-IANBD和2µL/mL PI。在微板上加入稀释系列抗肿瘤药物，加入药物后立即开始成像。

自动长期活细胞成像

为了实现全自动的长期成像，细胞被保存在BioSpa 8自动培养箱中，该培养箱与带有宽视野相机的Cytation 5细胞成像多模式阅读器耦合。BioSpa使细胞保持在37°C, 5% CO₂在72小时的实验过程中，湿度为80 - 90%，环境参数通过Agilent BioTek BioSpa软件实时监测和报告。2022世界杯附加赛决赛每隔2小时自动将微板从BioSpa培养箱转移到Cytation 5进行成像。cyation 5内的额外环境控制使细胞保持在37°C和5% CO₂在整个成像过程中。

单幅图像全井捕获

为了对384井微孔板进行全井成像，Cytation 5配备了宽视场相机，并配有4倍放大物镜。Cytation 5的广域视野可以对整个井的培养区域进行单幅图像捕获(见图1)。Cytation 5的成像配置如表1所示。用成像立方体GFP (469/525 nm)和PI (531/647 nm)分别检测动力学凋亡试剂盒试剂pSIVA和PI信号。对于无标记细胞计数，如前所述使用高对比度亮场的cyation 5⁵．

表1。2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen5软件的图像采集设置。

图像分析

使用Gen5软件进行图像处理，所用参数如表2所示。预处理减少了背景和增强了对比度，便于在所有通道中识别细胞。对于高对比度的亮场图像，处理结果是具有黑色背景的图像和与单元格对应的明亮的白色斑点。

表2。2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen5软件图像处理参数。

对预处理后的图像进行细胞分析，所有通道的参数如表3所示。对于每个通道，通过Gen5中的图像统计分析确定阈值。对对照井进行图像统计，取平均图像信号以上3个标准差作为阈值进行细胞分析。通过对高对比度亮场图像的初级掩模分析建立细胞总数。通过对GFP通道的初级掩膜分析，确定凋亡报告基因pSIVA阳性的细胞数量。坏死标记PI阳性的细胞数量是通过PI通道的初级掩码分析建立的。液体半月板引入了一种成像伪影，其中方孔的角落在明亮的光照下比培养区的其他部分略少(见图1)，与荧光计数相比，可能会引入无标记细胞计数的偏差。Gen5插头特征用于将细胞分析限制在明亮环境下最佳光照的井的区域(3400 m直径的圆)，相当于整个井培养面积的92%。因此，插头功能可以使用无标签细胞计数方法实现荧光细胞计数的无偏规格化。

表3。2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen5软件细胞分析参数。

曲线拟合与统计

使用Agilent BioTek Gen5软件收集和分析所有数据。2022世界杯附加赛决赛数据表示使用Gen5和GraphPad Prism V8软件。所有曲线拟合和EC₅₀在第5代进行分析。V的时间_马克斯Gen5的分析在线性回归的5点窗口内进行。使用Microsoft Excel中的学生t检验函数(双尾，未配对)进行统计分析。

结果与讨论

增殖的自动动力学分析

基于无标签图像的人纤维肉瘤细胞系HT-1080细胞计数在384孔板中每隔2小时进行一次。对于每口井，使用4倍物镜和高对比度Brightfield套件捕获一张图像。使用Gen5细胞分析建立细胞计数(图1)。

图1所示。无标签高对比度细胞计数方法。(A)用高对比度套件捕获的原始高对比度离焦图像。384孔板单井的总培养面积用蓝色虚线表示。(B)经过表2所示预处理步骤后的高对比度亮场图像。(C)安2022世界杯附加赛决赛捷伦BioTek Gen5细胞分析软件识别和计数HT-1080细胞(黄色)，显示在原始高对比度亮场图像上。

研究了斯陶孢素、诺可达唑、喜树碱和奈尼霉素四种抗肿瘤药物对肿瘤细胞增殖的影响。在t=0小时获得第一张图像之前添加药物。Gen5软件生成的细胞计数曲线提供了整个384孔培养皿增殖率的可视化概述(图2)。在Gen5培养皿概述中，很容易看出每种药物对增殖的不同抑制作用。

图2。细胞增殖384孔板概述。红色曲线表示在3天实验期间绘制的细胞计数。随着药物浓度从C排到P排的增加，在整个384孔板上观察到所有药物的增殖减少。

对于两种药物，诺可达唑和喜树碱，细胞计数在不同剂量下一起绘制(图3A，图3B)。为了进一步分析，对每种条件下的12个重复井进行平均并绘制在一起。为了量化每种药物对增殖的抑制作用，在Gen5生成剂量-响应曲线(图3C, 3D)。通过24小时单时间点分析，首次得到不同药物的剂量-反应曲线。

图3．剂量依赖性抑制HT-1080纤维肉瘤细胞增殖。平均细胞计数图被叠加在(A)诺可达唑(橙色圈，n = 12个重复孔)和(B)喜树碱(绿色圈，n = 12个重复孔)的不同浓度的三天内。误差条表示重复的标准差。2022世界杯附加赛决赛Agilent BioTek Gen5生成了(C)诺可达唑(橙色圈)和(D)喜树碱(绿色圈)在24小时单时间点无标签细胞计数的剂量响应曲线。4参数拟合用黑色实线表示，并插入IC₅₀值用虚线显示。对于诺多唑，IC₅₀相当于48纳米，喜树碱相当于12纳米。

Gen5提供了IC的额外比较₅₀值从积分分析曲线下的面积(图4)₅₀该值与药物暴露时间无关，并考虑了实验持续时间的变化。喜树碱，IC₅₀分析方法之间的值很一致。为了进行比较，还对奈尼霉素和诺科唑进行了AUC分析，证明了在IC的巨大变化中检测的敏感性₅₀(图4，面板C)。

图4。无标签增殖剂量-反应曲线与IC₅₀分析。(A)复盖喜树碱多个时间点的剂量-响应曲线，允许时间依赖性的IC比较₅₀值(18小时= 9.5 nM, 24小时= 12.3 nM, 48小时= 10.9 nM, 68小时= 8.2 nM)。对于每条曲线，4参数拟合是彩色的和IC₅₀插值用虚线表示。(B)第5组提供了IC的额外估计数₅₀值通过曲线下面积(积分)分析整个动力学系列(IC₅₀= 10 nM)。(C)三种药物的积分剂量-反应曲线。实线对应4参数拟合，虚线表示IC₅₀插值。集成电路₅₀喜树碱为10 nM，诺可达唑为39 nM，尼日菌素为193 nM。

基于荧光的动力学细胞死亡表型

除了对增殖的整体影响外，还使用凋亡和坏死的荧光报告器检查了细胞死亡的机制。在每个拍摄亮场图像的时间点，分别对凋亡标记物pSIVA和坏死标记物PI拍摄相应的荧光图像(图5A)。细胞被鉴定为pSIVA和PI信号阳性(图5B)，初级掩模识别出每个孔和时间点的单个细胞(图5B，见插图)。

图5。捕获和鉴定细胞凋亡和坏死阳性。(A)两个时间点pSIVA凋亡标记(绿色，上图)和PI坏死标记(红色，下图)阳性细胞的示例图像(如图所示)。384孔底部的区域由a (B)左上角的蓝色虚线表示。阳性凋亡和坏死细胞通过大小和信号阈值参数(见材料和方法)和原掩膜识别阳性细胞(插图为清晰显示放大区域)。

细胞凋亡定量分析

当磷脂酰丝氨酸暴露在细胞外间隙时，pSIVA的绿色荧光会增加。正如预期的那样，在抗肿瘤反应中，凋亡标志物pSIVA阳性的细胞数量随着时间的推移而增加，但在对照孔中保持相对稳定的低水平(图6A)。尽管在最高浓度和最低浓度的诺可达唑下，pSIVA阳性细胞的数量会随着时间的推移继续增加。这种积累是由于整个细胞群的持续增殖，尽管事实上许多细胞正在积极地经历细胞死亡。这种效应模糊了对结果的解释，以及左移欧共体₅₀合成剂量-响应曲线随时间变化的值(图6A，底部面板)。

为了控制细胞的持续增殖，以及在条件和复制之间细胞数量的任何初始变化，pSIVA阳性细胞计数可以表示为通过无标记细胞计数建立的总细胞计数的百分比。(图6 b)。

图6。细胞凋亡信号对抗肿瘤的响应。(A)诺可达唑在上述四种浓度下的凋亡细胞计数。注意，由于总细胞计数的增加，中间浓度的凋亡细胞计数继续上升。对于绝对细胞计数，生成了剂量-响应曲线，并拟合了指示的三个时间点。电子商务₅₀随着时间的推移，由于细胞增殖(EC₅₀24小时= 106 nM, EC₅₀48小时= 30纳米，EC₅₀68小时= 17海里)。(B) A图中凋亡细胞计数的相同数据，但归一化为总细胞计数(以百分比表示)。对于归一化凋亡细胞，所有剂量-反应曲线一致导致EC₅₀值约为100纳米。对于A和B的下部面板，Gen5 4参数拟合线以纯色显示，EC₅₀插补线显示为虚线。

重要的是，将凋亡计数归一化到总细胞计数表明，在给定的药物浓度下，凋亡细胞的百分比保持稳定，尽管无标记细胞计数和pSIVA阳性计数的绝对增加(图6B，上图)。此外,电子商务₅₀不同时间点的值随着时间的推移是稳定的，且标准化计数几乎相同(图6B，底部面板)。因此，当细胞在中等药物浓度下继续增殖时，仅基于绝对计数的凋亡荧光信号定量系统地大大低估了EC50值。

坏死定量分析

动力学凋亡试剂盒包括碘化丙啶(PI)作为坏死和晚期凋亡的报告者。当细胞和核膜都受损时，PI进入细胞并插入DNA;在细胞凋亡和坏死过程中，膜的完整性都丧失了。在这里，通过荧光成像监测和量化PI结合。与pSIVA信号一样，PI信号通常随着时间和药物剂量的增加而增加，如诺可达唑所示(图7A)。与pSIVA细胞凋亡信号一样，PI阳性细胞在中间浓度下也因增殖而增加。因此，PI阳性细胞也被归一化为使用无标记细胞计数占总细胞数的百分比(图7B)。

图7。抗肿瘤的坏死信号反应。(A)诺可达唑在上述四种浓度下的坏死细胞计数。注意，由于总细胞计数增加，中间浓度的坏死细胞计数继续上升。(B) A图中凋亡细胞计数的相同数据，但归一化为总细胞计数(以百分比表示)。

为了比较和定量药物疗效，我们对所有药物在24小时的归一化坏死和凋亡信号进行了动力学分析和曲线拟合(图8)₅₀= 100 nM，见图4面板C)，即使使用的最高浓度，也很少导致凋亡或坏死，EC₅₀细胞凋亡和坏死值未确定。

图8。电子商务₅₀细胞凋亡和坏死的测定。每种药物的坏死细胞百分比(左图)和凋亡细胞百分比的剂量-反应曲线。2022世界杯附加赛决赛Agilent BioTek Gen5 4参数拟合显示为每个拟合(实色线)以及插值EC₅₀值(虚线)。对于细胞凋亡，EC₅₀对应的值分别为:斯陶孢素24 nM、诺可达唑121 nM和喜树碱301 nM。对于坏死，EC₅₀相应的值分别为:staurosporine 28 nM, nocodazole 114 nM，喜树碱301 nM。电子商务₅₀在凋亡和坏死中，尼日霉素的值(红色)均未确定。

此外，尽管在EC中有相似之处，但与坏死百分比相比，staurosporine的最大平台值在凋亡百分比上达到了更高的水平₅₀两个进程的值。这种差异可能表明，staurosporine优先启动HT-1080细胞的凋亡。因此，我们还利用Gen5对凋亡和坏死信号的发生时间进行了定量研究。

在图9的面板A中，staausporine(蓝色)和喜树碱(绿色)的凋亡百分比和坏死百分比都显示出来。在肉眼观察中，用斯陶孢素处理的细胞，凋亡信号先于坏死信号。作为比较，喜树碱的细胞凋亡和坏死信号发生时间的百分比几乎相同，因为这两种痕迹明显重叠。为了量化这一差异，测量每条轨迹的Vmax参数的时间(详见材料和方法)。为了评估每种药物的Vmax时间，选择第一个接近凋亡和坏死百分比最高水平的浓度。各药物的Vmax时间见图9,panel b，只有staurosporine两种信号的起始时间存在差异，凋亡从坏死开始约3.5 h。这一发现表明，细胞死亡的机制主要是通过凋亡，导致坏死。

图9．细胞凋亡和坏死过程的起始时间比较。(A)细胞凋亡信号(填充的圆圈)和坏死信号(开放的圆圈)的例子迹线在同一细胞群中一起绘制。对于staausporine(蓝色痕迹)，而不是喜树碱(绿色痕迹)，细胞凋亡引发坏死信号。(B)细胞凋亡(简称“A”)与坏死(简称“N”)Vmax参数时间比较图。只有staurosporine在Vmax时间上有显著差异(p=0.000001)，细胞凋亡比坏死早发生约3.5小时。

结论

安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek Cytation 5细胞成像多模式读取器配有宽视场相机，配合安捷伦BioTek BioSpa自动培养箱，提供了一种全自动和健壮的细胞增殖和细胞死亡定量图像分析方法。宽视场相机可以对整个井的培养区域进行单一图像捕获，最大限度地减少了图像捕获时间，提高了小培养区域容器的高通量应用的兼容性。2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen5软件和细胞分析例程允许快速，自动识别细胞计数，无论是光场和荧光图像。使用无标记细胞计数的荧光信号规范化是避免EC偏倚的关键₅₀由于不同条件间增殖率的差异而确定的。

参考文献

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