荧光偏振法快速检测hERG安全性的高通量筛选检测技术分析

作者:Wendy Goodrich, BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT;马克Koeppel生活的技术

绝大多数与获得性QT延长相关的药物已知与hERG相互作用。由于意识到此类QT药物的潜在危险，监管当局在药物临床前开发期间发布了心脏安全检测指南。金标准测试方法，传统上是在临床前研究的晚期对先导化合物进行的，是在监管指南中批准的手动电生理学测试。这种费力的方法需要最终用户具有相当的技能才能成功进行测定。此外，许多研究人员希望在药物开发过程的早期测试先导化合物的安全性。这需要更高的通量类型的化验。在这里，我们描述了一种新的检测平台，适用于高通量筛选(HTS)应用，使用基于荧光极化的hERG抑制试验作为模型。通过检测对照和多个hERG抑制剂面板，仪器验证的药理学终点分析包括Z′、检测窗口、精度和平板读取时间。此外，基于fpga的IC₅₀数据生成并与电生理学和辐射测量数据进行比较。

简介

手动膜片钳电生理学平台是用于报告符合GLP的hERG安全试验的金标准方法，作为研究新药(IND)提交的一部分。自动化膜片钳技术(APC)的最新进展已经开始显示出有望成为金标准手工方法的另一种合规测试方法。尽管APC技术提供了自动化的更高吞吐量优势，每次测试的成本更低，但膜片钳技术仍然很慢，成本高，执行起来也很困难。

放射配基结合分析也被用于hERG风险评估，目的是在药物开发过程中为预测药物化合物对hERG的抑制提供更大的灵活性。能够提供与金标准相当的结果，并且在更高的吞吐量要求下优于膜片钳，这些分析是不符合hERG筛查的可行选择，但由于使用辐射，它们需要特殊的技术和治疗。

作为回应，Life Technologies Predictor hERG荧光极化分析方法被开发出来，以引入一种均匀混合和可读生化分析方法，该方法更快、更容易使用、无放射性、易于自动化，且每次测试的成本更低。在低体积高密度微板中进行的这种测定，已显示出可与膜片钳和放射配基方法相媲美的结果^[1]．

使用预测hERG分析作为模型，我们在这里展示了一种新的多模微板阅读器的敏感和快速荧光偏振检测能力，有利于高通量环境。

检测和测定原理

荧光偏振(FP)是一种荧光检测技术，由Perrin在1926年首次提出^[２]．它是基于观察到溶液中的荧光分子在受到偏振光激励时发射偏振光，但由于分子旋转，发射光的平面会与兴奋光的平面不同。分子的极化与分子的转速成反比，转速受其大小(分子体积)、溶液粘度、绝对温度和气体常数的影响^[3]．来自Life Technologies的Predictor™hERG荧光极化分析试剂盒提供了经过验证的组件，在没有辐射配基的情况下进行hERG通道生化结合研究。该检测基于荧光极化原理，其中红移荧光示踪剂被与通道结合的化合物从hERG通道中移出。较低的极化值与较大的示踪剂位移相关，因此表明更倾向于hERG结合^[4]．

图1所示。hERG荧光偏振分析原理。

Synergy™Neo是一种新的HTS多模微板阅读器，配备了多个平行顶部和底部单色仪和基于过滤器的检测器。易用性和用户信心是设计Synergy Neo独特的过滤器立方体的关键，这些立方体是为正过滤器ID编码的-消除错误的可能性和简化工作流程。专门的光学设备提供了超快的测量，有利于高通量的要求，包括一个FP立方分束器和非标准的高透射滤波器。

图2。Synergy™Neo荧光偏振检测原理和hERG检测参数。

材料与方法

材料

• 生命技术预测™hERG荧光偏振检测试剂盒(目录#PV5365)
• 阿司美唑(Sigma-Aldrich, A2861)
• Tocris生物科学目录第0937号
• 特非那定(Sigma-Aldrich, T9652)•E-4031(随试剂盒提供)
• 康宁384孔低体积黑色微板#3677
• BioTek Synergy™Neo HTS多模Microplate Reader (P/N NEOB):
  • 过滤器立方体4 (P/N 1035004)
  • 过滤器立方62 (P/N 1035062)
• BioTek Gen 5 v2.01.14软件

方法

仪器设置优化

运行1是一个孵育时间过程，根据试剂盒插入程序，通过检测阳性和阴性对照的16个重复，确定最佳的检测运行时间和检测器参数。数据如图5、6和表1所示。

仪器性能验证

在运行2中，按照套件插入中的步骤，如图3和4中的Plate Map和工作流所示，运行两个数据板，每个板上有两组化合物，以验证药理学数据端点。化合物以起始浓度1x104 nM的16点3倍连续稀释法滴定，每4次重复一次。阳性对照和阴性对照在两个平板上重复16次，以计算Z′和分析窗口。空白井进行了选择性数据校正，但未用于最终结果分析。

从孵育2小时开始，到孵育5小时，每小时读取每个培养皿，以比较试剂盒提供的孵育时间范围内的数据。生成了6个单独的测量/井设置(10、25、50、100、150和200)的数据，以关联检测灵敏度和读取速度。本试验的数据修正可以使用试剂盒说明书中描述的2种方法中的一种进行。校正方法B在图3所示的6-9和18-21列中加入10 μM E-4031，但对结果不做数据约束。

图3．分析图显示复合连续稀释剂、束缚(NC)和位移(PC)对照剂、游离示踪剂和空白孔的放置细节。无空白校正。

图4。Synergy™Neo上Predictor™hERG荧光偏振分析的仪器性能验证工作流程。

结果

Synergy Neo在Gen5™软件控制下自动生成的偏振数据导出到Microsoft Office Excel 2007和GraphPad Prism®中进行数据分析。

图5。运行1的代表性数据显示，作为独立于检测设置的孵育时间函数，检测窗口呈上升趋势。

图6。在孵育2小时和10 m/w的条件下运行2个检测窗口和Z '结果，对2片数据每片的读取时间为1分17秒。111-153是孵育时间为1-4小时时计算出的检测窗口的预期范围，相应的Z′值分别为0.56 - 0.77。Z′因子的计算采用Zhang等(1999)的方法。

表1。2小时试验孵育点下运行2的灵敏度和读取速度数据汇总。数据显示，探测测量/井之间的变化很小，在低米/水时相应的速度降低增强了高温高压测试工作流程的灵活性。

图7。4种已知hERG通道阻滞剂对各种测量/井的比较剂量响应数据显示，无论检测设置如何，每种化合物之间都具有高度相关性。表1显示了比较IC₅₀每个化合物的数据。

图8。具有代表性的剂量反应曲线。使用四种已建立的hERG通道阻滞剂验证检测性能，以显示其IC的等级顺序和效力₅₀值。对比数据见表2。

表2。Synergy Neo的Predictor™hERG验证数据与比较方法的代表性IC50值^[5]．数据显示，试验孵育2小时，10米/瓦特，读取时间为1分17秒。

讨论

的敏感性协同™Neo光学系统可靠地检测20 μL反应在384孔小体积(30 μL)微板格式的荧光偏振，总读取时间小于2分钟。

Synergy Neo通过广泛的性能设置为HTS工作流提供了增强的灵活性，可以在不牺牲读取速度的情况下生成敏感数据。如表1所示，即使将最低测量值/井位增加2.5倍，以校正数据的轻微变化，也只会使板读取时间增加1.4倍。

Synergy Neo生成的数据具有非常高的精度，并且产生的Z′和分析窗口值与在孵育时间、测量/孔设置和读取速度范围内的分析预期值一致，如图5、6和表1所示。

图7和表1所示的四种已知hERG抑制化合物的数据表明，在不同的测量/井和读取速度下，药理学结果高度相关。

协同Neo提供了hERG抑制数据，该数据与膜片钳和Radioligand方法的既定文献值一致，如图8和表2所示。

监管指南建议在药物化合物用于人类使用之前进行hERG安全性测试。通常，金标准手动膜片钳电生理学的结果作为新药研究过程的一部分提交。筛选分析技术执行起来更容易、更快、更便宜，同时仍然产生与金标准方法相比的数据，可以在高通量药物发现/开发环境中增强研究工作流程。反过来，这可以帮助减少对更慢、更昂贵的确认性测试的需求。如图所示协同™Neo基于Predictor™hERG荧光偏振分析技术生成的数据，多模微板读取器可以在1分17秒内对384孔板产生敏感的检测结果，从而支持更高吞吐量的安全测试需求。

参考文献

1. S7B人类药品对心室延迟复极(QT间期延长)的潜在作用的非临床评估，工业指南，食品和药品监督管理局，2005年10月，http://www.fda.gov/downloads/药品/指南/指南/ucm074963.pdf
2. FDA IND法规(21CRF312.23)，“药物第一阶段研究临床试验新药申请(IND)的内容和格式”指南(www.fda.gov/cder/guidance/phase1.pdf)，以及“审查员药理学/毒理学评审格式指南”(www.fda.gov/cder/guidance/4120fnl)。pdf)
3. S7A人用药物安全药理学研究，《人用药物注册技术要求协调国际会议(ICH)指南》，2000年11月，http://www.ich.org/产品/指南/安全/安全单/文章/安全药理学- Studies for Human - medicines .html乐鱼平台入口
4. 黄锡平等。三种筛选平台在学术药物发现环境下识别人类醚- go-go相关基因调节剂，分析与药物开发技术2010年12月;8(6): 727-742, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/ PMC3002179/
5. Comley,博士。约翰，研究离子通道筛选8年了，有什么变化吗?，药物发现世界(DDW) 2011年秋季，http://www.ddw-online.com/筛选/p149022-8年的调查离子通道筛选- has-anything- change-fall-11.html
6. 杨丽媛、杨永宁(1990)。离子通道的超家族。自然,345:672。
7. ^[1]Piper等人，使用膜蛋白富集方法开发预测hERG荧光极化分析，分析和药物开发技术(ADDT)，卷6，第2号，2008©Mary Ann Liebert, Inc。DOI: 10.1089/ adt.2008.137 pgs 213 - 223
8. ^[２]Perrin, F.(1926)荧光偏振。Vie Moyenne de Molecules dans L 'etat Excite。物理镭7:390。
9. ^[3]赫尔德，保罗，“()Predictor™hERG荧光偏振分析使用BioTek的Synergy 2多模式阅读器”应用笔记，BioTek®Instruments, Inc.Winooski Vt, 2008。
10. ^[4]Life Technologies Predictor™hERG荧光偏振分析协议。
11. ^[5]http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/ Predictor-hERG-FAQ-General.pdf

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