2017年7月7日
作者BioTek仪器公司应用部门的Bridget Bishop, Keri Raymond, Simone Rieger和Paul Held
荧光蛋白已成为当今生物分子研究的主流。它们体积小、易于使用、波长可变性和不需要基质，使这些遗传元素成为回答无数实验问题的有用工具。在这里，我们描述了与荧光蛋白相关的几种常用技术。此外，还提供了荧光蛋白的广泛列表，相关的激发和发射波长以及建议的过滤器和镜像组合。
简介
在过去的15年里，绿色荧光蛋白(GFP)已经从一种几乎未知的蛋白质转变为一种常见的分子检测和成像工具，用于生物学、化学、遗传学和医学等多个科学领域(图1)。GFP的自催化能力以及相对容易的遗传编码能力使其理想地减少了许多用于研究生物过程的程序的侵入性。GFP和GFP样蛋白(即色素蛋白和其他荧光蛋白)由于其稳定性以及其发色团(即负责GFP颜色的蛋白区域)是在65SYG67序列的自催化循环中形成的(图2)而非常有用。由于GFP不需要辅助因子，它可以在多种条件下发出荧光[1]。
图1．表达GFP的NIH3T3细胞的绿色荧光。
GFP最初发现于水母Aequorea victoria中，是一种天然荧光单体蛋白，由238个[2]氨基酸组成。它在A. Victoria被自然产生的生物发光蛋白aequorin激活，该蛋白与钙结合后释放蓝光。绿色荧光蛋白吸收蓝光激发蛋白质荧光，然后发出绿光。
此外，当GFP作为融合蛋白转染细胞时，它不会改变蛋白质嵌合体的功能和位置。这使得GFP具有多种用途，因为它可以用于定位在细胞内移动的蛋白质，以及监测蛋白质翻译[3]。
图2。绿色荧光蛋白的结构。野生型A. victoria GFP的三个氨基酸残基Ser65、Tyr66和Gly67自发发生连续的翻译后反应，在桶状蛋白[4]的核心形成发色团。
突变和变异
通过改变发色团[1]周围的氨基酸残基，可以改变GFP的荧光颜色和荧光强度等特性。GFP的这些突变提供了许多颜色变体，如蓝色和黄色。这些变化的GFP可用于构建荧光嵌合蛋白，在转染工程载体后在活细胞、组织和整个生物体中表达。已经从包括珊瑚礁生物在内的其他物种中分离出了其他颜色，如红色荧光蛋白，并用于需要一种与GFP[6]不同特征的荧光蛋白的分析。RFP发射波长较长，这使得它与现有的共聚焦和宽场显微镜兼容。RFP对整个生物体成像的能力也更强，对红光更透明。表1全面列出了可用的荧光蛋白，它们的光谱特性和合适的滤光片。
许多GFP的突变被创造出来以优化GFP效率或增加表达。例如，一种被称为GFPuv的实验室突变已经经过优化，当被紫外线(UV)激发时可以发出荧光。突变导致更亮的荧光和更理想的表达特性。它包含三个氨基酸替换(Phe到Ser在#99,Met到Thr在#153,Val到Ala在#163)，改变蛋白质折叠并最终形成发色团[6]。当GFPuv在大肠杆菌中表达时，它比野生型GFP (wtGFP)更容易溶解。用GFPuv与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)一起准确分析孢子表面显示系统，需要比wtGFP表达更优的荧光蛋白。当GFPuv在枯草芽孢杆菌中表达时，证实在孢子上存在CotG-GFPuv蛋白[9]。当去除CotG锚定基序时，没有荧光记录，证实CotG在孢子表面显示系统中是一个必不可少的锚定基序。据报道，显示GFPuv的孢子可用于细胞外或细胞内刺激[7]的其他信号应用。
还进行了其他的改变，以改善蛋白质折叠和发色团的形成。除了氨基酸替换，如GFPuv突变，许多其他沉默突变已对野生型序列。以密码子在DNA序列中的变化为例，可以反映预期宿主的密码子偏倚。通过破坏wtGFP中一个名为mGFP4的隐性内含子而产生的突变在高等植物中非常有用，因为当表达[8]时，它能发出更亮的绿色荧光，有别于植物正常的绿色颜色。绿色荧光蛋白导入其他生物基因组的能力为细胞、分子和发育生物学打开了许多新的大门。GFP的成功表达发生在许多不同的细胞中，包括细菌[7]、酵母[9]、植物[10]和哺乳动物[11]。整个生物体都经过基因改造，可以发出完全绿色的光。这些荧光蛋白中的许多都可以作为蛋白质标签，一种生物发光报告因子，可以很容易地表达，而不干扰标记蛋白的正常功能和运动。
GFP的其他突变体也可以提供蓝色发射特性(BFP)，但这些突变体通常荧光量子产率低，光漂白速度快，使其效果有限。针对BFP发色团附近的残基进行突变分析，发现了一个量子产率增强的变体，为0.55(参考原始BFP的0.34)。这种BFP突变体，称为蓝铜矿，也降低了pH敏感性，更耐光漂白[16]。它在细菌和哺乳动物细胞中表达良好，它的发现扩大了可用于检测和成像的荧光蛋白的调色板。
当某些蛋白质被荧光蛋白标记时，标记的蛋白质和荧光蛋白之间的相互作用可能会打乱目标和/或产生不良的结果。许多野生型黄到红荧光蛋白具有四聚体活性，对天然蛋白[10]具有毒性或破坏作用。荧光蛋白mRFPI，“DsRed”来自Discosoma物种。(蘑菇珊瑚)是一种真正的单体荧光蛋白，通过定向进化来增加成熟速度，并在恢复荧光的同时打破每个亚基界面。自最初开发以来，mRFPI进行了几次修改，得到了进一步的改进。这些改进包括更快速的成熟、更强的n端融合耐受能力、更高的荧光量子产率和更强的光稳定性，使它们能够用于更广泛的测定[10]。
已经研究了参与GFP荧光的过程。例如，激发态质子转移(ESPT)是导致和控制GFP荧光的过程，也是最近发现ESPT的替代质子受体的一项研究的主要焦点。质子从嗜色团移动到电离侧链(E222)，导致形成阴离子发色团。如果这条侧链重新定向或换出另一条链，则ESPT被禁用，当chomophore被激发[14]时，会造成相当大的绿色排放损失。然而，当引入第二个突变时(本研究使用了名为H148D的GFP蛋白变体)，绿色排放恢复了。这一结果以及E222/H148D双突变的类似结果支持了D148侧链是ESPT[14]中质子受体的理论。利用时间分辨荧光光谱和振动光谱对荧光发射的进一步探索表明，发色团的苯基羟基和D148侧链之间存在低势垒氢键。这不仅进一步加深了我们对蛋白质间质子转移的理解，还表明wtGFP中的氢键网络可以被单个残基[14]取代。
基因表达
基因表达的评估已成为当今分子和细胞生物学中最常用的工具之一。转染的克隆DNA序列的永久和瞬间表达都有助于测定启动子的转录活性。不幸的是，在大多数情况下，启动子的自然产物无法定量分析。在过去，这个问题的解决方法是将启动子与一个报告基因连接，该基因编码一种具有独特酶活性的蛋白质，如β-半乳糖苷酶，可以很容易地测定。基因活性水平将被监测作为酶活性的功能。这些分析，虽然容易执行，通常相当定量，但由于不能实时测量，通常需要制作细胞裂解液，并在这些裂解液之后进行反应。这些实验的最大问题是酶在储存和实际测定期间的稳定性。近年来，固有荧光蛋白(如GFP)的使用已经消除了这一问题，GFP已成为评估基因表达和转染效率的一种方法。
显然，单体荧光蛋白有许多用途，其中许多是近年来发展起来的。基于荧光蛋白的荧光共振能量转移(FRET)对的显微镜已被用作报告媒介，但由于硬件上的限制，往往会带来困难，使细胞筛选和细胞生物学中的其他过程复杂化。科学家们试图通过筛选单体荧光蛋白对来弥补这一缺陷，以找到最佳组合，该组合将提供理想的高动态范围FRET变化，高pH值，高光稳定性，快速成熟和明亮的荧光，以及在任何成像系统中可靠的检测。也许最广泛用于筛选新的或改进的FRET对的生物传感器设计涉及蛋白酶裂解试验(图3)。简单的基序由两个荧光蛋白通过一个包含蛋白酶裂解位点的短肽连接在一起。一般来说，传感器表现出很强的共振能量转移，而这种共振能量转移在连接子序列断裂时完全消失。利用这些信息，可以监测活细胞中蛋白质的相互作用，并产生基于FRET的传感器。例如，Casper3-GR (Everogen)是CasperR3[15]的一种商用衍生物，为细胞凋亡提供了一种实用的检测方法，类似的结构可能在未来的细胞生物学研究和高通量筛选试验中非常有用。
图3．荧光蛋白FRET蛋白酶活性生物传感器。两个荧光蛋白(天蓝色和金星)是由一个短肽包含一致的蛋白酶切割位点连接。
由于GFP容易与目的基因融合，且通常不干扰正常基因功能，因此在需要基因表达的实验中被频繁使用。已知含有GFP的转座元件可用于检测基因表达，使基因功能失活，也可诱导基因错位或过表达。这些特性已与一种称为启动子陷阱的技术结合使用。启动子陷阱采用无启动子cDNA (GAL4 cDNA)表达GFP，该构建被插入到[16]的转录单元中。一旦插入，GAL4就会激活转座子中包含的编码gfp的基因(图4)。因此，通过获得功能来识别特定于组织的基因启动子。由于该构建有望提前终止内源性基因，因此在载体中插入了一系列FLP重组酶位点。该转座子包含gfp编码基因和GAL4 cDNA，可以通过FLP重组酶插入和移除，从而刺激标记基因的条件误表达。使用这个启动子陷阱是因为它允许研究特定插入内功能的增益和损失。例如，启动子陷阱技术已经被用于识别一组控制蘑菇体一部分的细胞，这是昆虫大脑中的一对结构，与学习和记忆特别是嗅觉[16]有关。
图4。(a) GAL4是酵母转录因子。(b)它结合一个特定的酵母启动子(UASG)。任何由UASG控制的基因都会在表达GAL4的细胞中被激活。(c)将含有UASG结构的果蝇与GAL4杂交，任何基因都可以表达细胞特异性[16]。
非化验
许多近距离检测，如lanthscreen®，使用荧光共振能量转移(FRET)来提高信号背景比。这是一种时间分辨的FRET (TR-FRET)，常用于定量多种靶点，如蛋白激酶、核激素受体或蛋白酶。TR-FRET实验使用长寿命的镧系螯合物作为荧光供体，GFP部分作为受体。图5显示了TR-FRET的一个可视化示例。时间分辨组分很重要，因为镧系螯合物具有独特的激发态寿命，可以持续超过1毫秒，显著长于大多数荧光化合物的平均激发态寿命，通常以纳秒为单位测量。这个测量值相当于目标分子被光子[17]激发后在激发态所花费的平均时间。长半衰期的供体分子允许延迟50-300微秒后停止兴奋光和FRET信号的测量。这种延迟为克服荧光半衰期短得多的常见背景干扰提供了手段。
图5。激动剂介导的受体激活导致ERK2磷酸化示意图。刺激表达GFP-ERK2融合蛋白的活细胞促进ERK磷酸化。(B)刺激后，向细胞中加入含有tb标记的抗phospho- erk2 [pThr185/pTyr187]抗体的lanthscreen细胞裂解液。抗体的结合提供了从激发的供体荧光团Tb到GFP的能量转移所必需的密切联系，导致TR-FRET信号的增加。结果是基于裂解液的免疫分析，其中GFP作为tb标记的phospho-ERK2抗体供体的FRET受体。[18]
FRET是一个建立良好的研究蛋白质相互作用和细胞筛选的系统，但像任何方法一样，也有其局限性。为了克服这些局限性，其他方法如生物发光共振能量转移(BRET)已经被利用。BRET使用的是酶催化发光，而不是FRET/FLIM型筛分[19]所使用的荧光。它是一种无辐射的能量转移形式，可以发生在能量供体和表达的GFP(能量受体)之间，但不需要兴奋光。BRET提供了一个易于高通量筛选应用的分析读数(图6)。两个目标分子可以用荧光素酶和荧光蛋白标记，使BRET作为一个传感器，检测成对细胞蛋白[19]之间的相互作用。这消除了许多问题，可以发现与FRET/FLIM，如自动荧光和光漂白。BRET是有用的，因为它可以很容易地在体内实时检测蛋白质相互作用，也以信号依赖的方式[19]。
图6．BRET系统示意图。候选蛋白用生物荧光素酶标记，目标蛋白用GFP突变体标记。当两个蛋白质紧密排列在一起时，它们之间的相互作用引起共振能量转移[23]。
成像
分析GFP及其变体特别有用的活细胞成像应用，允许监测生理过程的动力学反应。事实上，GFP是使用成像微孔板阅读器进行高含量筛选的主力。用于G蛋白偶联受体检测的一种常见检测方法是Transfluor™检测，该方法使用β-Arrestin-GFP融合蛋白来跟踪激动剂治疗后GPCR受体的内化情况。该方法已被用于筛选小分子化合物，使用成像微孔板阅读器在单细胞水平上可视化内化事件[75]。
GFP及其一些变体已被用于大量的研究中，通过分析融合蛋白来确定特定蛋白的定位。例如，GFP已被用于在活细胞中定位Rho gtpase[86]。Ras和Rho家族GTPase与不同的荧光蛋白融合，使得对CAAX蛋白如何靶向特定细胞膜的理解取得了突破[91]。利用GFP与羟甲基戊二酰- co还原酶(HMGR)融合，证实了GFP在酵母中用于膜蛋白定位和降解的实用性[90]。对这种核定位方法的一个警告是，由于其体积小，GFP可以通过核孔扩散到细胞核。只有仔细分析融合蛋白的完整性，才能确定核定位[85]。已经建立了酵母GFP融合定位数据库[87]、哺乳动物基因LIFEdb蛋白数据库[88]和植物拟南芥[89]等大型数据库，为蛋白质定位提供了可检索的档案。
除了常规和共聚焦显微镜亚细胞定位，一种新的方法使用双光子双色显微镜最近已经探索使用蓝色和红色荧光蛋白。双光子显微镜是一种成像技术，它可以对活体组织进行小散射成像，可以替代共聚焦显微镜。该方法可同时研究两种颜色在组织或细胞中的表达、定位和转运，可达到非常高的深度[20]。传统上，荧光分子具有相似的激发波长，但其斯托克斯位移差异较大。通过筛选多个橙色和红色荧光蛋白的光谱得到最优的双光子特性，蛋白tagRFP被鉴定为[21]。
然后将这种蛋白质与一些蓝色、蓝绿色和绿色的蛋白质配对，其中mKalama1被发现是最理想的。该方法通过同时激发蓝色荧光蛋白的最低能量电子跃迁和红色荧光蛋白的高能量电子跃迁，不需要很大的斯托克斯位移差异，也可以用于许多具有双光子吸收效率和更好成像性能的荧光蛋白对，如其他GFP突变和颜色变化[21]。
干细胞
胚胎干细胞(ESCs)的发现和体细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSCs)开辟了许多新的研究途径。利用荧光蛋白作为荧光示踪剂来监测干细胞几乎是例行公事。早期人类ESC的工作集中在使用荧光蛋白作为非侵入性标记。在延伸因子- α启动子的控制下，EGFR组成型表达的胚胎干细胞系建立[83]。这些细胞系作为未分化的ESC，以及诱导分化后都会产生EGFP[83]。除了作为一种简单的示踪剂外，荧光蛋白还可用于监测未分化的ESC表达。在Oct4启动子控制下，EGFP永久转染ESC，可以长时间表达。诱导这些细胞的分化或靶向敲除Oct4表达可导致EGFP荧光的降低。
诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells, iPSCs)是一种被重新编程的体细胞，从其分化状态恢复为能够分化为不同种系细胞的多能细胞。在初始重编程期间，与标准的微孔板阅读器相比，荧光蛋白使用成像系统进行监测。由于大多数重编程细胞不会产生多能性，因此使用传统的微孔板读取器测量人群的平均信号不能用于识别阳性的iPSC克隆，但延时成像已被用于许多不同的方法来证明和监测诱导干细胞的多能性。例如，使用慢病毒重编程系统生成iPSCs，其中四个定义因子(Klf4、Oct4、Sox2和c-Myc)，称为重编程所需的KOSM，与绿色荧光蛋白(GFP)标记一起在帧内融合为单个开放阅读。诱导多能干细胞形成的真正证据是将其注入卵囊后能够从多个胚层产生细胞。无创使用GFP信号成像跟踪细胞系已被用来证实单盒慢病毒能够在小鼠中产生可存活的诱导多能干细胞[84]。培养的表达GFP的尾尖成纤维细胞(TTFs)用第三代Lentiviral系统感染，该系统包含原始的Oct4, Klf4, Sox2和cMyc盒，目前常规用于生成iPSCs。GFP的表达也被用来确定转导效率，并证明胚胎中的多种胚层衍生物[84]。
荧光蛋白也被用于识别成功重编程的关键细胞属性。活的表达GFP或yfp的重编程小鼠胚胎细胞随时间成像。通过对形成iPSC菌落的细胞的回顾性分析，增殖速率的快速转变和细胞面积的减少被认为是成功重编程的指标[80]。一旦多能性建立，它由转录因子的核心调控网络维持，然后可以使用与内源性蛋白表达相似的荧光蛋白来监测该网络[76]。使用编码EGFP、Oct4、Sox2、Klf4和cMyc的Lentiviral系统诱导的细胞，通过FACS分析和基于GFP表达的细胞分选，建立了稳定的大鼠诱导多能干细胞[82]。绿色荧光蛋白的表达已被用来证明细菌人工染色体(bac)在产生胚胎干细胞转基因克隆中的实用性。在转基因克隆中使用BACs而不是小质粒可以最大限度地减少转基因的插入位置沉默。将神经细胞系特异GFP转录融合文库(GENSAT)中的bac导入胚胎干细胞，通过抗G418筛选得到。只有诱导ESCs分化时，GFP的表达才明显，这表明BACs在ESCs中的功能是正确的[79]。
有趣的是，并不是所有的荧光蛋白对ESCs都是一样的。已经建立了几种能够在体外和体内转基因表达荧光蛋白ECFP、EYFP和EGFP的ES细胞系。然而，使用DsRed-1很难获得类似的细胞系，这表明这种荧光蛋白不是发育中性的[77]。将DsRed逐步突变到单体mRFP1，为ESC研究提供了可行的红波长标记物[78]。
记者技术
荧光报告蛋白的多功能性导致了许多用途，例如它们在活细胞中涉及基因表达的分析中使用。目前，荧光蛋白被用于鉴定和分离胚胎系统细胞群。利用荧光团有许多可选择的遗传标记。这些典型的融合蛋白与一个小的启动子片段连接，通常需要许多不同的组合才能找到合适的标记。科学家们正试图通过一种更普遍的基因标记来减少前期试验，并产生一种保留ATG起始位点上游内源性调控序列的报告基因。开发了一系列具有独立报告基因、细菌选择和真核选择的多模块遗传标记质粒，与细菌人工染色体(BAC)技术[11]兼容。一种自切割肽将绿色荧光蛋白报告基因与原生开放阅读框(ORF)和早期心脏标记(NKX2-5)基因(胚胎系统细胞的标记)连接起来。使用大型bac可减少与该基因报告基因的局部整合效应，而切割肽可减少蛋白质融合引起的伪迹。该标记物被表达并用于分化小鼠胚胎系统细胞的检测。这些结果表明，NKX2-5细胞报告细胞系是一个很好的用于研究心肌细胞形成早期过程的细胞系。 [11].
荧光蛋白在活细胞中提供信息的能力使其成为癌症研究的理想材料。例如，ZsGreen荧光蛋白已被用于研究肺癌[22]中的癌症干细胞。肿瘤干细胞(Cancer stem cells, CSC)是具有自我更新能力的肿瘤细胞的子集。一种假设是，通过消除肿瘤来源的csc，就可以“治愈”肺癌。CSCs最初被认为存在于培养的肺癌细胞的侧群(side population, SP)中，但新的数据表明，一些非SP细胞具有自我更新的能力。SP细胞的测定是基于其肺癌细胞外排赫斯特染料的能力。来自人类肺癌细胞系A549和H1299的肺肿瘤球与单层培养的相应细胞[22]相比，表现出形态学上的差异和干细胞标志物的表达增加。采用鸟氨酸脱羧酶c端ZsGreen荧光蛋白嵌合体检测蛋白体活性。ZsGreen-cODC报告实验是蛋白酶体降解的一个靶点，通过绿色荧光可以识别缺乏蛋白酶体活性的细胞。与单层细胞相比，肺肿瘤球显示26S蛋白小体活性降低。 This assay was used with Non small cell lung cancer (NSCLC) cell lines to identify and enrich for cells lacking proteosome activity, where it has been shown that less than 1% of the NSCLC monolayer cells were positive, while spherical cells were greatly enriched for fluorescence. [22].
荧光蛋白可用于指示肿瘤细菌中基因启动子的活性。例如，与正常组织相比，肠道沙门氏菌更喜欢感染实体肿瘤。确定在实体肿瘤中优先激活的沙门氏菌基因启动子将有助于阐明这一现象。研究人员从编码荧光蛋白TurboGFP[23]的无启动子基因上游克隆了S. enteric鼠伤寒菌14028的基因组文库。该文库被注射到无瘤裸鼠和同样生长在裸鼠体内的人类PC3前列腺肿瘤中。两天后，用荧光激活细胞分选法对脾脏或肿瘤细胞进行分选，鉴定并富集表达GFP的细胞。与沙门氏菌基因组的寡核苷酸阵列杂交显示，肿瘤样本中有86个基因间区域富集，而脾脏中没有。这些候选启动子中的20个也从一个文库中随机克隆中发现，该文库在生长的肿瘤细菌中富集表达。对3个候选启动子克隆进行了体内实验。在生长于肿瘤而非脾脏的细菌中，GFP表达增加。 Two of those clones are known to be induced in hypoxic conditions similar to those in tumors [23]. While many of the other candidate promoters’ regulatory mechanisms may not be related to hypoxia, these findings have potential to improve the targeting of drug delivery.
绿色荧光蛋白及其多种变异在细胞分析和分子成像中是非常有价值的工具。他们帮助我们在许多领域，包括信号应用，蛋白质之间的质子转移，FRET/FLIM显微镜和许多其他领域，帮助理解细胞和蛋白质的结构和功能。这也有一些缺点，因为没有一个单一的GFP变体适合所有的应用，但每个版本在活细胞的定量成像方面都有不同的优势。由于GFP不需要外界刺激就可以折叠成荧光结构，因此即使在变性物质或蛋白酶的存在下，以及在大范围的pH和温度[24]下，它都是非常稳定的。这些特性以及GFP在不干扰蛋白质正常功能和运动的情况下进行报告的能力，使其成为未来涉及医疗应用的伟大工具，例如消除癌症肿瘤。
表1。荧光蛋白波长最大值和建议的过滤器组合。
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