2009年7月7日
作者:Paul Held博士，高级科学家，BioTek Instruments, Inc.应用部门
摘要
基于发光的分析是基因表达研究的支柱之一。长时间持续发光反应的发展使得这项技术可以作为一种手段来筛选大量的化合物，因为它们能够调节特定基因目标的表达。Synergy阅读器产品线的专用发光光学设备并不是为使用高密度1536孔微板而设计的。在这里，我们描述了在Synergy™4多模微板阅读器中使用荧光光路来测量高密度微板的发光。
简介
根据光输出的持续时间，发光反应被分为两大类:闪光和辉光。闪光，顾名思义，是一种短暂的反应。这些反应通常在几秒钟内达到峰值强度并迅速消散。因此，闪光发光检测通常需要与读取器集成的液体分配器来添加试剂，以便能够记录短时间的检测信号，通常是动态的。发光反应发生的速度要慢得多，通常会产生一个稳定的信号，持续几十分钟到几个小时。这些反应不需要集成的注入器，因为信号在很长一段时间内是稳定的，在读取器检测之前，可以处理大量的微板进行试剂添加。这些属性使发光反应非常适合大量样品的筛选分析。这一特性还允许将发光分析的密度缩小到1536孔，以增加样品吞吐量和降低每个孔的分析成本。
Synergy 2和4系列阅读器提供了一个专用的发光探头，捕获发射的光，并将其通过发射滤光轮，随后到达光电倍增管(PMT)探测器。虽然这一专用光导在引导光到PMT方面非常有效，但探头尺寸太大，无法容纳1536孔微板的小孔。
当使用这种光学仪器时，会显示警告信息，提示用户探针尺寸过大(图1)。然而，荧光光学仪器使用不同的孔径用于不同的井密度，有能力测量1536孔微板中的荧光。在这里，我们描述了使用荧光光路检测和定量发光在1536孔微板。
图1。当发光光学被选择读取1536孔微板时，显示警告信息。
材料与方法
激酶Glo检测试剂盒(目录号V3772)和ATP(目录号V222A)从Promega公司(Madison, WI)购买。纯白色96孔(目录号3912)和1536孔(目录号3937)微板来自康宁(Corning, NY)。用蒸馏水作为稀释剂，对0 ~ 500 μ M的ATP进行一系列稀释。每种稀释液的等量(100µL)重复8个移液到96孔微板的孔中。
加入等体积(100µL)的激酶Glo试剂，将所提供的稀释剂与冻干试剂混合，使其新鲜，然后加入，让平板孵育5-10分钟。孵育后，10µL的反应移液至1536孔的微板中，随后进行发光测定。
发光测量使用Synergy 4多模微板阅读器。从顶部使用发光或荧光读取模式进行测定。所有测量的PMT灵敏度设置为135。数据采集采用Gen5中默认的发光采集参数。此外，在荧光模式下，比较了50%镜面、510截断二色镜和无镜面等不同顶部光学对1536孔微板发光的采集。
结果
测试了不同的读取模式在1536孔微板中测量发光样品的能力。如图2所示，在1536孔板中，发光模式和荧光模式都可以检测到发光信号。毫不奇怪，专用发光光学是捕获光信号的最有效手段。
荧光光学也可以成功地用于测量发光。对于发射光的波长，使用通用的50%反射镜或专用的二色反射镜都可以对发光信号进行量化。这种光路相对于专用发光光路固有的低效率在返回的信号中很明显。因为50%的镜子反射一些光，不管波长，它比专用的二色镜效率低。
图2。高ATP浓度下荧光和荧光检测模式的比较。
当检测到ATP水平明显降低时，发出的光明显减少。正如预期的那样，专用发光光学在光收集方面是最有效的。为了减少由于使用荧光光路而造成的光损失，将二色镜从光路中移除。如图3所示，在测量发光信号时，当顶部探针光学中没有镜面时，可以观察到信号大约有5%的改善。
图3。高ATP浓度下荧光和荧光检测模式的比较。
图4。不同检测方式的井间交叉比较。对于高井，不同检测方式的平均发光信号归一化为1000。每个数据点代表8个测定的平均值。
通过测量一个非常亮的信号和测量相邻井中发光信号的增加来评估来自附近井的串扰。大的专用发光光学导致高信号井产生明显的串扰。如图4所示，相邻空井的信号可以接近实际实验井的40%。这种信号的增加在任何方向上2-3口井都可以观察到。使用384孔或更低密度的微板时，这种串扰不明显。荧光光学在邻近井中显示很少串扰(4-8%)，在距离高信号2个位置的井中观察到背景水平。在与荧光光学系统使用的不同反射镜配置中，“无反射镜”组合和510 nm二向色具有相同的结果，而50%反射镜导致相邻井的串扰值略高。有趣的是，发光光学显示串扰轻微向左倾斜，而荧光光学则轻微向右倾斜。这很可能代表了相对于井心位置的差异。
讨论
虽然Synergy™2和Synergy™4多模微板读取器并不是专门设计来测量1536孔格式的发光反应，但这些数据表明，读取器有一定的局限性。在使用荧光检测方式时，需要仔细选择顶部光学器件。从镜像块中的三个镜像位置之一移除一个镜像会获得最佳性能。然而，Gen5™数据分析软件不直接支持没有镜像。你必须在软件查找表的那个位置创建一个自定义镜像。选择假镜将导致通过镜子块的开放空间进行测量。如果熟悉发光反应所发出的光的输出，就可以使用正确的二色镜，而信号损失很小。例如，萤火虫荧光素酶、荧光素和ATP相互作用产生的发光反应，其发光波长为570 nm。用于荧光素的标准510nm截断二色线将在这些波长工作。就像任何真正的荧光反应一样，选择合适的镜子是必要的。 The generic 50% mirror also produces very adequate results. Selection of this mirror type is wavelength independent.
在使用荧光光学进行发光测量时，用户需要了解荧光测量和发光测量之间的差异。发光读取自动关闭灯，然后默认为“孔”或打开的光圈为发射过滤器，但允许用户使用过滤器，如果需要在读取步骤设置。当使用荧光模式时，灯不关闭，用户决定使用什么滤光片位置。当使用荧光光学测量发光时，为激励滤波器选择一个“插头”是至关重要的。在这个位置使用滤光片会导致样品被光照，这是不可取的。与发光一样，用户可以选择使用“孔”或波长特定的过滤器。
发光模式和荧光模式的典型PMT灵敏度设置是不同的。在测量发光反应时，使用的PMT灵敏度设置比通常用于荧光的PMT灵敏度设置高。在荧光条件下，推荐的PMT设置一般在35到120之间，而在发光条件下，推荐的PMT设置在100到255之间。虽然两种读取模式之间有一些重叠，但在使用荧光光学测量发光时，建议使用发光的默认值135。这将在Gen5™数据分析软件中自动触发一条警告消息(参见图5)，当被询问是否希望返回Read Step对话框时，可以通过选择“No”按钮忽略该警告消息。
图5。当使用荧光光学器件进行读数时，使用发光的默认PMT设置时发出的警告消息。
荧光光学可以用于必须从板的底部进行的发光测量。专用液体光导只适用于顶部读数测量。在某些情况下，从96孔板和384孔板的底部读取发光反应是可取的。这种检测模式需要透明的底板进行光传输，以及选择荧光光学器件来完成读取。PMT灵敏度、激发和发射滤波轮位置和荧光读取模式的选择与顶部读取类似。虽然5毫米底部探头适用于大多数96井板，但它的尺寸相对于384井板的井径要求使用固体不透明的透明底板，以防止井间串扰。而无清底实心面1536微板;这种测量方式不建议用于1536孔板，即使它们是。
在这里，我们描述了使用荧光光学测量1536孔微板发光的无文件记录。使用荧光光学使研究人员可以利用这些光学器件的较小孔径尺寸，而通常用于发光测量的专用液体光导则无法利用这些光学器件。虽然使用荧光光学捕获的光量比发光光学要少，但井与井之间的串扰程度要小得多，这使得它成为高密度板更理想的选择。