细胞显微镜的十大技巧

1.样品制备

样品准备是确保高质量图像的关键。当从组织培养瓶中收获细胞时，细胞应具有足够的密度，并使用适当的解离液去除，以保留基本的细胞功能。在实验过程中使用无菌技术防止污染，避免不必要地引入可能对图像质量产生负面影响的外来颗粒或细胞碎片。

对于活细胞分析，荧光探针需要是细胞膜可渗透的，以评估细胞内的结构和功能。在进行实际检测之前优化浓度和孵育时间，以保持细胞活力，同时仍然确保足够的荧光。注意潜在的背景荧光-可能有必要在成像前合并清洗步骤。总之，这些将有助于提供具有良好信号与背景比的活细胞图像。

对于固定细胞分析，如免疫荧光，始终使用经过验证的固定/渗透/染色方案，包括添加阻断剂以防止非特异性结合，并在必要时优化抗体浓度。

2.样本船的注意事项

用于显微镜的样品容器的底部厚度很重要，因为倒置显微镜通过这个厚度来观察样品。不同的容器有不同的底部厚度。一些常见的容器底部厚度包括:

• 显微镜载玻片盖玻璃:0.17毫米
• 普通塑料微板:0.5毫米
• 低密度微板:1.0 mm

新的微板，专门开发成像，有底部厚度接近盖板玻璃。当使用较低的数值孔径物镜(< 0.7)成像时，血管底部厚度不是一个大问题。然而，当使用高数值孔径(0.8或更大)的空气物镜时，仅几微米的容器厚度变化就会导致图像退化。随着血管厚度的增加，像差变得更糟。矫正项圈是用来补偿这些错误的。该项圈允许在物镜内调整中央镜头组的位置，并确保无论使用何种类型的容器都能正确聚焦图像。

3.小区数优化

通常情况下，当有更多的细胞时，基于细胞的分析更可靠。细胞成像有点棘手;电镀太多的细胞会导致细胞在彼此上面生长，混淆了细胞计数或其他评估的正确分割。电镀过少的细胞会使细胞亚群分析在统计学上无显著性和偏斜。电镀后和处理后的孵育时间也应考虑到细胞数量的确定，因为细胞繁殖可以在实验的准备和执行过程中继续进行。

4.细胞类型

各种各样的细胞类型可用于细胞成像，包括永生化细胞系，原代细胞和干细胞。显微镜应用中使用的大多数细胞类型本质上是粘附的;如果处理得当，这些细胞就会粘附在井底，形成一个二维细胞层。2D是最直接的成像格式，因为细胞在一个平面上，可以使用成像仪的自动对焦功能找到。

悬浮细胞，如红细胞和白细胞，也可以成像。这些细胞类型缺乏粘附在表面上的能力，需要额外的操作将它们限制在用于显微镜的血管表面的单个焦平面上。悬浮细胞可以转移到有盖玻片的显微镜载玻片或有盖玻璃的血细胞计上，这限制了细胞的轴向，并提供更好的图像清晰度。使用微板，离心步骤也可以用于诱导细胞到井底。

更复杂的生物学，如组织和三维(3D)细胞结构，也已被纳入基于图像的实验过程。与单个2d镀细胞相比，其大小和形状的差异使得更先进的成像程序成为必要。组织样本通常可以比显微镜物镜提供的视场大得多，特别是如果需要高分辨率的高数值孔径物镜。图像蒙太奇程序在整个组织中捕获大量的图像，然后可以拼接成一个单一的合成图像，然后可以用于分析。3D细胞结构包含数百到数千个细胞，不仅在x轴和y轴上延伸，而且在z轴上也延伸。捕获跨多个z-平面的z-堆叠图像集，再加上z-投影图像处理，可以获得比任何单独的z-堆栈图像具有更好焦点的合成图像。这种z投影的合成图像可以提高任何后续分析的准确性。

5.荧光团和成像滤波器组

使用最好的荧光团对成功成像至关重要。荧光探针或蛋白质的激发光谱和发射光谱应与可用的LED光源、激发和发射滤波器以及二向色镜相匹配，以确保满意的荧光信号。荧光团的斯托克斯位移是一个需要考虑的重要变量，因为狭窄的斯托克斯位移会导致过多的背景荧光和对背景的信号差。如果多个荧光团以多路复用格式一起使用，则需要进行额外的优化。分子光谱趋于广泛，激发光谱和发射光谱都可能发生重叠，导致一个荧光团渗透到另一个荧光团的荧光通道。如果两种荧光团在细胞内的同一区域共定位，这是特别重要的。

6.适当的关注

自动对焦是自动成像中最常用的方法。无标记检测需要使用亮场或相位对比成像通道进行图像聚焦——未标记的细胞与背景的对比有限，因此样品的适当照明是至关重要的。最初使用手动成像来找到样本适当聚焦的z高度是有帮助的。将该值合并到容器的z-高度应该添加到软件中的容器定义规范中，以便使用适当的z-高度开始自动对焦过程，这可以最小化对焦时间。

与荧光成像，自动聚焦可以完成使用信号从包含的荧光标签。虽然这在许多情况下可以提高对焦的便便性，但仍然存在某些注意事项:具有强信号的荧光团可以轻松找到适当的焦平面，最大限度地减少聚焦在每个样本上的时间。相反，具有弱信号或高背景信号的荧光团会降低图像内的对比度，并可能导致图像失焦。在使用具有高数值孔径和有限景深的物镜时，还需要考虑到荧光团对细胞特定区域的定位。使用核染色剂将导致准确聚焦在细胞核上，但使用时。从定位于质膜的荧光团发出的图像荧光的第二个通道，图像可能不正确聚焦，因为两个细胞隔室存在于稍微不同的焦平面上。一个固定的z偏移量可以容纳这种差异，并且可以很容易地纠正这种差异。

最后，当样品在多个井或视场的同一焦平面上具有较高的置信度时，可以使用固定聚焦来代替自动聚焦。当需要粗略地观察实验或过程的状态时，也可以使用固定聚焦。通过消除自动聚焦程序，在尽可能快的处理时间内，立即对所有样品进行成像。

7.建立最佳的图像采集(曝光)设置

适当的图像采集设置对于获得有意义的、可量化的数据和适合在出版物中使用的图像至关重要。这些设置通常包括激发光强，相机增益和积分时间。定性显微镜使用图像采集设置，提供最佳外观的图像。定量数码显微镜调整曝光参数，以便尽可能多地使用相机的整个比特深度。

当对实验成像步骤中包括的所有井使用固定曝光时，如果可能的话，使用阳性和阴性对照来建立曝光设置。这将有助于避免像素饱和，同时保持曝光，也将准确量化测试样品之间的荧光变化。饱和像素无法精确量化，导致数据集在动态范围的最大末端被截断。相反，通常用于隐藏“背景”细胞荧光的参数设置过低，会截断动态范围最小端的数据，并再次扭曲定量测量。手动成像也可用于此功能，然后将最终参数转移到自动成像步骤。如果在测试井之间或样品井和控制井之间预计荧光会发生变化，则不应使用自动曝光功能，因为成像仪将试图通过相应调整参数来补偿高信号和低信号。这将导致数据的规范化，并消除预期的分析窗口。如果正在分析单个样本，或者实际信号值之间的比较不是分析标准的一部分，自动曝光对于启动优化过程是有用的。

8.动态成像

动态成像实时跟踪细胞变化可以产生重要的细微差别，否则在单个端点图像中可能会错过。动态成像的另一个好处是能够根据一段时间内捕获的图像创建电影，除了数值量化之外，还允许预期变化的可视化。然而，与所有成像一样，必须遵循一定的指导方针，以确保捕获尽可能好的图像并获得数据。

动力学实验过程建议采用固定曝光法。最有可能的是，人们希望量化样本在潜伏期内发生的变化，而固定暴露将阻止动力学时间段内的数据归一化。如果预期信号减少，则使用正控制进行参数优化。如果预期增长，则使用负控制。但是，要注意不要选择过低的设置，以免信号的预期变化落在测定的线性范围内。荧光团也应该是稳定的，在整个成像过程中对光漂白的敏感性较低。

9.像素的转变

当成像路径中的滤光片转移光线时，就会发生像素漂移，导致高分辨率CCD相机检测到的图像发生漂移。通常，这是由于排放过滤器不是均匀的厚度，称为过滤器楔。当使用不同的滤波器集获得同一物体的两个或多个图像，然后叠加以同时查看来自多个荧光团的荧光时，这种转移就会出现问题。由不同荧光团产生的图像将不能准确地关联或组合，因为每个图像根据每个滤波器集中发现的楔角进行了不同的移位。因为即使是最昂贵的物镜和滤波器也会有一些像差，校准程序被用来纠正这种现象。对于自动数字显微镜，这通常是在LED和客观校准步骤中完成的。使用明场作为照度的参考，通过确定孔径中心来测试每个LED和物镜组合的像素移位。计算出的每个像素位移然后用于偏移图像，以便覆盖在适当的位置。多色图像中的单个颜色也可以在使用某些数字显微镜软件中的通道移位工具成像后重新定位。例如，在单独的荧光彩色成像步骤中移动的活标本可以导致不同颜色与重叠图像的轻微错位。因为不同的颜色通道是按顺序成像的，所以图像之间有一个短的时间间隔，可以捕捉标本的运动。 The channel shift tool allows the researcher to reposition the channel in order to correct for the movement.

10.营造良好的环境条件

长期动态活细胞成像通常需要一定的环境条件控制，以保持样品的活力。温度是主要考虑因素。虽然大多数哺乳动物细胞在37°C生长，但如果使用细菌或酵母细胞，则可能需要更高或更低的温度。手动预设，或在程序中加入温度控制步骤，可以确保成像时保持适当的温度。大气控制也很关键。例如，维护5% CO₂/成像室中95%的空气为哺乳动物细胞提供了适宜的环境。当两者结合时，提供正确的温度和大气条件可以使活细胞成像在不牺牲样品完整性的情况下进行。