2000年11月5日
BioTek Instruments推出Select系列仪器。powerwave精选扫描微孔板分光光度计是一种吸光度板阅读器，具有测量吸光度从紫外到近红外范围的96孔和384孔的能力。此外还有ELx405选择多功能清洗机，采用专利96/384歧管设计，提供独立控制的抽吸和分配管位置。该特性可以在384个井板中实现无气泡流体分配和溢出保护。
简介
今天的研究要求仪器具有成本效益，可靠，易于使用。实验室中常用的两种仪器是微皿清洗器和读取器。自动化洗板机的目标是去除微孔板井中未结合的液体内容物，同时允许结合的产品保留。乐鱼平台入口洗涤液被分配到板的井中(泵送或重力给料)，然后抽真空，通常是通过真空或吸入装置。一般情况下，分装由歧管中的一组分装管完成，抽气由吸入管完成。为了快速清洗板，清洗过程在尽可能多的微孔板上同时进行。微孔板阅读器的功能是在比色测定完成后确定微孔板中溶液的吸光度。或者，可以使用连续的周期性测量在一段时间内监测动力学测定，但为了保持适当的测定条件，必须提供温度调节。无论阅读模式，快速和准确的测定吸光度测量是最可取的。随着最近微孔板的出现，其基质更紧密(即384口井)，与传统96口井格式的总体占地面积相同，384口井的微孔板已经很难提供与传统微孔板标准相同的功能。 To meet these needs and others, BioTek Instruments has introduced the选择系列。ELx405精选微孔板清洗机提供了一个能够清洗96孔和384孔微孔板的歧管。PowerWaveX Select是一款紫外/可见微孔板分光光度计，能够读取96孔和384孔微孔板。
ELx405 Select采用BioTek Instruments的专利流形设计，克服了高密度微孔板所带来的困难，并允许几乎相同的功能与16x24矩阵384孔板，预期与8x12格式化96孔微孔板。如图1所示，分配器和抽气歧管被放置在两个物理上不同的部分，这两个部分相互排列在一起。下部歧管(分配器)的构造方式是允许来自上述歧管(吸入)的管通过分配器并进入微孔板的孔。为了使分配管能够在抽吸管从同一口井中抽出流体时将流体分配到小井中，就像进行溢流和底部清洗时的情况一样，分配管从垂直方向倾斜(图1)。这使得分配管偏离井的中心，为抽吸管提供空间，但仍然允许流体射流从侧面进入井中。这种倾斜的设计还有一个额外的好处，即提供了流体的旋转运动，从而导致更有力的清洗。
图1所示。洗衣机歧管总成的示意图侧视图。抽吸和分配歧管在物理上是分开的，以允许单独控制每个歧管。倾斜的分配管允许流体旋转进入井中，同时允许吸入管同时进入384孔微孔板中的同一口井。这种独特的专利设计允许独立的高度控制，在384孔微孔板中实现无气泡流体分配和溢出保护。
的PowerWaveX选择微孔板分光光度计是一种多通道吸光度板阅读器，具有测量96孔和384孔微孔板从紫外到近红外范围的吸光度的能力。这种单色仪的波长范围为200-999 nm，不需要吸光滤波器，可以对小至1 nm的物质进行光谱扫描。采用氙气闪光灯对高精度衍射光栅单色仪进行了照明。然后将单色光分成8个实验通道和1个参考通道。实验通道以交错阵列模式集中到微孔板样品上，消除了通道之间的串扰。未被吸收的光被聚焦到硅二极管探测器上(图2)。温度调节由四区控制系统提供，确保优越的温度均匀性。通过利用仪器的近红外性能，可以在液体样品中自动校正样品路径长度(图3)。这允许使用分析物的消光系数而不是标准曲线，从吸光度测量中直接定量未知样品浓度。该阅读器可以在不到40秒的时间内读取384孔的微孔板，吸光度范围为0-4 O.D.。此外，PowerWave具有紧凑的占地面积和RS232连接XSelect与许多常用的首选机器人系统兼容。
图2。PowerWave原理图X选择光学。氙气闪光灯用于高精度衍射光栅单色仪的照明。然后将单色光分成8个实验通道和1个参考通道。然后将实验通道以交错阵列模式聚焦到微孔板样品上，从而消除了串扰。未被吸收的光被聚焦到硅二极管探测器上。
结果
采用多种方法测量了ELx405精选垫圈的点胶精度和精密度。利用水的近红外吸光度，可以计算微孔板中水溶液的体积。通过比较已分配到384孔微孔板中孔的977 nm PBS的吸光度与先前也在384孔微孔板中制备的标准曲线(体积与吸光度)，可以确定每孔的体积。如表1所示，使用这种测定方法，在100 μ l的设置下，预期分配体积与确定分配体积之间的差异小于2%。当每个孔中分配50 μ l时，与期望值的偏差小于4%。这些数值与通过测量将液体注入微孔板后微孔板的重量变化所确定的数据非常吻合(表1)。假设水的比重为1.00 g/ml，可以计算出每口井的平均体积。
图3。384孔微板的路径长度校正。将体积从10 - 100µl(100µg/ml)的DNA样品倒入384孔微板中，一式三份。测定260 nm处的吸光度，并进行路径长度校正和不进行校正，并绘制平均吸光度与样品体积的关系。
图4。流形高度对最终分配容积的影响。吸气歧管被设置在四个不同的高度。在每种情况下，使用ELx405精选洗衣机将PBS + FD&C黄色染料#5分配到384孔微孔板中。在所有四个板中，每个孔设置的设置为300 μ l，在分配完成时的最终体积取决于吸入管的高度设置。清洗后，所有384个孔的吸光度在450nm处使用µQuant微孔板阅读器测定。这些数据代表了384口井的平均吸光度测定值。
采用吸光度法测定点胶精度。利用每个孔的吸光度，方差系数(%CV)可以用吸光度的标准偏差除以微孔板的平均吸光度来计算。当使用吸光度为977 nm的PBS时，在50 ml和75 ml的分配中观察到约6%的%CV(表2)。当选择100 ml的体积时，该值下降到小于5%。这些数据与使用含有FD&C黄#5的水溶液并在450nm处测量吸光度时产生的吸光度数据非常一致(表2)。当每孔300 ml分配到96孔板时，发现4个板的平均%CV为2.12%，这表明每孔分配更大的体积可以获得更高的精度。
通过测量3x100毫升溶液前后384个孔微板的重量来确定液体吸入效率，并进行最终的吸入洗涤循环。由于清洗微孔板而导致的重量增加表明微孔板中残留有液体。使用这种方法，当384孔微孔板被清洗时，10次独立测定的平均残留体积计算为每孔约0.27 ml(表3)。96孔平底微孔板的残留体积小于1 ml(数据未显示)。
图5。DNA浓度曲线。浓度曲线从0到104µg/ml，样品体积为100µl，减去空白水。实线表示数据的线性回归分析结果，圆型表示各浓度下四种测定值的平均值。采用KC4数据缩减软件进行线性回归分析。
由于抽吸高度可以用来“过填”384孔微孔板的井，因此进行了几次实验来测试这种能力。抽吸管高度可用于通过ELx405垫圈影响分配器的最终体积，通过将抽吸管降低到384孔微孔板的孔中，可以控制孔中剩余的最终体积。如图4所示，当含有FD&C黄色染料的液体被分配到384孔微板中，高度设置从40 (5 mm)到100 (12.5 mm)不等时，分配液体的吸光度随高度设置而增加。在所有实验中，相同数量的染料溶液(300 μ l)被分配到微孔板。
| 预期 | 计算量* | |
| 分配体积(µl) | 吸光度法(µl) | 重量法(µl) |
| 50 | 52.018 | 51.86 |
| 75 | 76.281 | 76.53 |
| One hundred. | 98.686 | 100.89 |
*表示384个决定的平均值。
表1。分配精度到384孔微板。使用两种不同的方法测试了ELx405精选垫圈的分配精度。吸光度法表示一个微孔板384孔的平均测定体积。通过将每个孔在977nm处的吸光度与之前制备的体积-吸光度标准曲线进行比较，计算出每个孔的体积。权重法表示384口井中每口井的计算液体体积，即分配液体的重量变化量除以井总数。
| 每孔分配容积(µl) | 微孔板(%CV)* | 96孔微板＆450海里Abs。 | ||||
| 977海里Abs。 | 450海里Abs。 | |||||
| 50 | 6.27% | 9.85% | N/A | |||
| 75 | 6.11% | N/A | N/A | |||
| One hundred. | 4.92% | 3.78% | N/A | |||
| 300 | N/A | N/A | 2.13% | 2.09% | 1.99% | 2.28% |
*表示384个决定的方差系数。&表示四个不同板上96次测定的方差系数。
表2。分配精度到384和96孔微板。通过计算两种不同吸光度测量值的方差系数(%CV)来确定384孔微孔板的分配精度。将PBS或含FD&C黄染料#5的PBS溶液按规定体积分配到384个孔微板中，分别在977 nm或450 nm处测定吸光度。所提供的数据代表了384孔微孔板在每个指定体积下的CV %。采用含FD&C黄染料的PBS对96孔常规微孔板的分布精度进行了测试。这些数据代表了来自四种不同微孔板的平均%CV(96次测定)。
的PowerWaveX选择微孔板分光光度计有许多能力，使其适合今天的分子生物学家。图3展示了PowerWave的能力X选择以校正样本路径长度。当测量不同体积的DNA溶液的吸光度时，可以看到样品体积和吸光度之间的直接关系。随着样品体积的增加，微孔板的孔被更大程度的填充，导致光吸收路径长度增大。然而，当所有样品的路径长度校正为1厘米时，每个样品的“校正”吸光度非常接近相同的值。校正后的吸光度值可以与报告的消光系数一起使用，直接计算样品浓度。请注意，如果没有路径长度校正，基于消光系数的计算将导致异常结果。
表4所示的数据证明了PowerWaveX Select确定核酸浓度的能力。当使用吸光度测量已知浓度的DNA的连续稀释浓度时，与预期结果相比，观察到非常密切的相关性(表4)。这些数据表明，PowerWaveX Select提供的路径长度校正足以通过微孔板吸光度测量进行准确的直接浓度测定。使用KC4数据缩减软件控制读取器功能并执行数据缩减，可以使用几种不同的曲线拟合来最佳拟合数据。如图5所示，当测量序列稀释DNA在260 nm处的吸光度时，可以使用线性回归分析来最好地描述数据。这些数据也证明了Power WaveX Select微孔板阅读器的光学线性。
图6。水中DNA的光谱扫描。使用PowerWaveX Select微孔板分光光度计从200nm到999nm每1nm扫描三个不同的孔。100 μ l样品在Greiner 384孔微孔板(cat# 781801)。微孔板在每个波长处的背景吸光度被减去。
图6展示了PowerWaveX Select执行光谱扫描的能力。当将水溶液中的DNA以1 nm的增量从200 nm扫描到999nm时，可以在260 nm处观察到一个显著的定量峰，表明核酸的存在。还观察到在977nm处有一个小但重要的峰，这是水吸收这个频率的光的结果。这个“水”峰值用于路径长度校正。在水样中，微孔板孔中的吸光度与1厘米试管中的吸光度之比相当于微孔板样品的光吸收路径长度。
测试 |
初始(通用) |
最终(通用) |
δ(通用) |
/卷(µl) |
1 |
64.3600 |
64.5367 |
0.1767 |
0.4602 |
2 |
64.5309 |
64.6566 |
0.1257 |
0.3273 |
3. |
64.5314 |
64.6495 |
0.1181 |
0.3076 |
4 |
64.5918 |
64.6532 |
0.0614 |
0.1599 |
5 |
64.5956 |
64.6444 |
0.0488 |
0.1271 |
6 |
64.5469 |
64.6738 |
0.1269 |
0.3305 |
7 |
64.5823 |
64.6568 |
0.0745 |
0.1940 |
8 |
64.5695 |
64.6716 |
0.1021 |
0.2659 |
9 |
64.5710 |
64.6654 |
0.0944 |
0.2458 |
10 |
64.5824 |
64.6789 |
0.0965 |
0.2513 |
意思是(米l) = |
0.2670 |
|||
表3。384井格式的剩余测试。从10个不同的384孔微板的残余体积是通过称重空板之前和之后3 x 300 μ l的洗涤周期与最终吸气。洗涤缓冲液由PBS + 0.1% Tween 20组成。初始权重和最终权重之差(Delta)除以井总数(384口)，计算出每口井的平均剩余体积。还测定了所有10个微板的残余体积的平均值。
样本数量 |
将浓缩的。（米g / ml) |
观察浓缩的。（米g / ml) |
1 |
104.0 |
103.14±0.34 |
2 |
52.00 |
52.27±0.14 |
3. |
26.00 |
26.34±0.13 |
4 |
13.00 |
13.34±0.06 |
5 |
6.500 |
6.75±0.07 |
6 |
3.250 |
3.42±0.05 |
7 |
1.625 |
1.73±0.05 |
8 |
0.812 |
0.88±0.03 |
9 |
0.406 |
0.47±0.03 |
10 |
0.000 |
0.03±0.04 |
表4。预期和实验测定DNA浓度的比较。以蒸馏水为稀释剂，对DNA进行连续稀释。每种稀释剂各取100µl，放在384孔微孔板中，一式三次，在260 nm处测定吸光度。使用路径长度校正，将吸光度值与校正到1厘米路径长度的水对照进行隐去，并使用转换因子计算DNA浓度:1 od相当于50µg/ml浓度。观察到的浓度用三个重复的平均值±平均值的标准差表示。
讨论
Select系列仪器为高通量筛选(HTS)提供了完整的微孔板包。的PowerWaveXSelect提供路径长度转换技术，允许通过测量260 nm的吸光度直接定量核酸或通过A260/A280比值测定评估核酸纯度。蛋白质浓度可以通过280nm直接定量或使用任何数量的不同比色法测定。使用四区控制系统进行温度调节，确保了动力学分析所需的优越温度均匀性。具有紧凑的占地面积和RS232连接，PowerWaveXSelect还与许多常用的首选机器人系统兼容。
几个标准功能已包括，使ELx405洗衣机机器人友好和理想的自动化。提供真空检测等功能，以确保真空泵已接通，真空容器已连接。流量保护提醒用户分流管汇的流量中断。废物收集系统设有废物液位检测装置，通过软件防止废物溢出进入真空泵。由于缓冲液是通过隔膜泵的吸力从储层中抽出的，因此在操作时不需要加压缓冲容器。一个可选的缓冲区切换模块允许从多达四个不同的缓冲区自动切换。洗衣机也有一个单独的上料槽，允许自动上料(“自动上料”)和自动漂洗(“自动上料”)在洗涤过程中。该ELX405是机器人友好的OCX组件，允许轻松集成到多个机器人设备。分析方案可以从单独的PC机上下载或通过洗衣机键盘编程。除了多功能之外，该洗衣机重量轻(< 13.5 Kg)，结构紧凑(41 x 41x 26 cm)，能够在110伏和220伏操作。