在光谱的紫外区使用适当的微板测量吸光度的重要性

作者:保罗·赫尔德，生物科技公司的科学家

你的microplate有正确的东西吗?

96孔微板的选择在光谱的紫外区进行吸光度测定时是至关重要的。在本报告中，我们比较了几种不同的微板在紫外范围内的背景吸收特性。

简介

由于聚苯乙烯或聚丙烯在电磁波谱可见部分的光吸光度非常低，在进行基于微板的测定时，历史上很少关注微板本身产生的背景吸光度。如果有问题，通常的校正方法是利用双波长测量来校正背景。这种校正方法的前提是，在所使用的两个不同波长处，微板的背景吸收是一致的。然而，在光谱的紫外范围内，大多数微板的情况并非如此，这使得在进行测量时选择板的关键。历史上，一次性聚苯乙烯或聚丙烯塑料和玻璃倾向于吸收紫外线范围内的光，因此在测量紫外线范围内的吸光度时必须使用石英井。随着“紫外线透明”塑料的出现，一次性微板现在可以用于能够在紫外线范围内阅读的微板阅读器。

材料与方法

在每个孔中填充100 μ l的蒸馏水，以1 nm的增量从200 nm到800 nm测定吸光度。对几种不同的96孔微板进行了检查，包括Hellma石英(cat。# 730.009-QS)， Costar UV板(猫。# 3635)， Polyfiltronics UV-MAX板(cat。# UV-MAX)， Nunc Maxisorp(猫。# 442404)， Costar聚丙烯(cat。# 3794)。所有扫描吸光度的测定都是使用PowerWave 200扫描微板分光光度计(BioTek Instruments, Winooski, VT)进行的，同时使用外部PC机上运行的KC4数据还原软件(BioTek Instruments, Winooski, VT)来控制读取器功能和数据捕获。

结果

如图1所示，石英微板在被测微板中具有最低的背景吸光度。海尔玛96孔微板(A)在200 nm处的背景吸光度为0.086。这个值逐渐下降到平均0.028，在800nm的可见光谱范围内变化不大。传统聚苯乙烯，如Nunc Maxisorp (E)或聚丙烯微板，如Costar聚丙烯(D)，其吸光度值约为2.800，这代表了我们在本研究中使用的阅读器在该波长的最大吸光度值。聚苯乙烯板对波长200 nm到275 nm的光几乎是不透明的，背景吸光度在波长超过275 nm时迅速下降，在300 nm处为0.400，在375 nm处小于0.050。聚丙烯虽然在200纳米处同样不透明，但在较低的紫外波长处，其吸光度略低于聚苯乙烯。聚丙烯从230 nm处的约3.000迅速下降到240nm处的小于1.000，在250nm到290 nm处有一个轻微的次级峰。当波长为300 ~ 800 nm时，聚丙烯微板的本底从0.350逐渐减小到0.075。一次性的“紫外线透明”微板在紫外线波长中表现出比传统塑料微板更好的吸收特性。虽然Costar UV板(B)在200 nm处的背景吸光度约为1.800，但在230 nm处的背景吸光度迅速下降到0.100，在260 nm处的背景吸光度为0.050。 The background absorbance in the visible light wavelengths was found to be approximately 0.025. The Polyfiltronics disposable UV microplate (C) has an absorbance at 200 nm of 2.500, which quickly drops to 0.090 by 250 nm. Interestingly, a small secondary peak was observed from 255 nm to 290 nm, where the background absorbance increased to 0.200. With wavelengths above 300 nm the background absorbance was very similar to that observed with the Costar UV microplate.

图1。几种不同微板的光谱分析。使用PowerWave 200扫描微板分光光度计从200 nm到800 nm以1 nm的增量扫描微板。在每个病例中，扫描在含有100 μ l蒸馏水的孔中进行。

讨论

很明显，当在紫外波长进行测量时，微板的选择比在光谱的可见部分更为复杂。因为一次性微板通常是由某种类型的塑料聚合物制成的，背景吸光度可以根据波长而显著变化。在这项研究中，石英被证明在吸收特性方面优于所有的一次性微板测试。然而，石英微板非常昂贵，而且不能一次性使用。石英板由于破损或污染的损失会导致重大的经济损失。传统的聚苯乙烯或聚丙烯微板，虽然非常适合光谱可见光部分的吸收测定，但不适用于紫外范围的测定。专为紫外线波长设计的一次性微板适用于紫外线范围内的大多数应用，但背景吸光度随波长的变化而变化，如果使用的波长低于制造商指定的波长，则背景吸光度会变得显著。

虽然我们已经在这些微板的指定范围之外的波长上使用了一些微板，但我们认为，注意这样做的后果是重要的。如果在多个UV波长下稳定、优越(即低)的背景吸光度是绝对必要的，那么石英微板就是解决方案。另一方面，如果需要一次性微板进行紫外线吸收测定，则需要专门设计的“紫外线透明”微板。如果要检查多个紫外线波长之间的关系，如A₂₆₀/一个₂₈₀与核酸样品的比值(1)，则必须在每个波长进行适当的消隐，以考虑到微板在不同波长的背景吸光度的差异。

微板的选择必须包括几个不同的因素。虽然石英在本底吸光度方面表现出优越的特性，但它不是一次性的，价格昂贵，并且可以与某些物质(如氢氟酸)发生反应。传统的聚苯乙烯和聚丙烯微板是可靠的，便宜的，并提供吸附特性，使他们适应许多不同的测定。然而，由于它们的背景吸光度相对较高，这些板不能用于需要在光谱的紫外部分进行测量的测定。新推出的“紫外线透明”微板具有传统一次性微板的许多优点，以及紫外线的相对透明度。它们的背景吸光度在紫外线范围内的不同波长下会有一定程度的变化，因此必须注意纠正这一点。

参考文献

(1) hold, P. Application Note, BioTek Instruments, Winooski, VT。