微板悬浮培养物的生长监测

利用光散射来动态记录细胞数量的变化

细菌和酵母菌是具有重大经济和医学意义的微生物。我们对细菌和酵母菌生命周期的大部分了解都来自对它们随时间增殖的监测。通常，这是通过光密度(OD)测量来完成的(图1)。这种测量的应用范围从用于克隆的能力细菌生成的常规检查^[1]；研究细胞生理学和新陈代谢^(2、3)；确定抗生素耐药性的增长速度^(4、5)；以及发酵过程中生物量积累的监测^[6]举几个例子。

图1．典型的细菌生长“吸光度”曲线。有利于生长的培养基，当接种低浓度的细菌时，由于细菌数量和大小的增加，测得的“吸光度”会随着时间的推移而增加。当营养耗尽时，生长就会减慢并最终停止。使用LogPhase™600微生物学读本，每2.5分钟测量600nm的吸光度，持续12小时，读本之间不断晃动。

悬浮培养中单细胞生物的生长可以用浊度或光散射测量来监测。随着细胞数量的增加，溶液变得越来越浑浊或浑浊，因为穿过溶液的光被存在的微生物散射了^[7]．在不服从比尔定律的情况下，随着光散射的增加，到达探测器的总光束的百分比减小，并记录为吸光度(图2)。

图2。600纳米浊度测量的基础。与真正的吸收不同的是，光不是被吸收的，而是在光从缓冲液到电池时，由于折射率和密度的变化，电池内的分子对入射光产生衍射。一些绕射光会从光路偏转到探测器，并被读取器记录为光密度。光散射造成的光损失程度受悬浮粒子和仪器光学结构的影响。

在1900年左右，瑞利勋爵首次描述了基于光散射的细胞悬浮液定量。光不被吸收，而是细胞内的分子衍射入射光。许多绕射光会从光路偏转到探测器，并被读取器记录为光密度。光散射造成的光损失程度受悬浮粒子和仪器光学结构的影响。细胞特异性效应因子包括:细胞大小、膜组成、内部细胞器解剖结构和细胞密度^[8]．仪器光学尺寸，如吸收材料与探测器之间的距离，聚焦透镜的存在或不存在，以及光束的大小都影响“光散射”信号^[9]．

这些光散射测量通常使用600纳米或接近600纳米的光源进行。600纳米波长的使用在某种程度上是基于历史波长，当时微生物学家使用的是1939年开发的简单的KLETT-Summerson色度计，该色度计在20世纪60年代流行，带有固定滤光片(红、绿、蓝)，不可能调整波长^[10]．蓝色(600 nm)滤光片具有提供对生物样品无害的低能量光和对大多数细菌肉汤混合物的低干扰的附加优势。

图3。大肠杆菌稀释剂的吸光度测定。在2XYT培养基中培养大肠杆菌过夜，用新鲜的2XYT培养基稀释，用Log Phase 600微生物仪在600 nm处测定吸光度。数据反映了每稀释8次重复的平均值。

大多数细菌和酵母只将光线散射几度^[11]，因此，从电池到探测器的距离和聚焦孔径的半径将决定光在探测器上的损失程度(图2)。随着电池数量的增加，入射光被粒子多次散射的概率也会增加，通常称为多次散射状态。有了这种现象，比尔-兰伯特定律不再是一个合适的近似，OD曲线预计将变平(图3)₆₀₀高于0.5的读数与浓度不再是真正的线性关系。在OD值的基础上比较不同的样品可以很容易地相对地进行，但为了计算有机体的细胞数量，需要进行某种校准。

图4。麦克法兰标准在两种不同的微板读取器上吸光信号的差异。将McFarland光散射标准(150 μL)混合到透明的平底微板中，每2.5分钟动态测量一次，持续1小时(25次测定)，并测定每个孔的平均值。8个重复井的平均值和标准偏差被绘制为标准报告的细菌当量的函数。同一个平板被测量在两个不同的BioTek微板阅读器上。

有许多方法来校准OD₆₀₀悬液培养的数值，以确定实际的细胞浓度。最准确的方法是将稀释的悬浮液培养在琼脂板上。镀膜后，在固体底物上形成的每一个菌落都是单细胞的克隆扩展。因此，一体积的悬浮液所形成的菌落的物理数量等于细胞浓度。虽然这种方法相当准确，但却非常耗费劳力，而其他估计细胞数量，特别是细菌数量的方法已经被开发出来了。一个这样的估计是麦克法兰标准。麦克法兰标准最初是通过将特定数量的氯化钡和硫酸混合形成硫酸钡沉淀而制定的^[12]．目前，乳胶珠具有同样的用途，而且保质期更长。指定为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0的标准对应的细菌浓度为1.5、3.0、6.0、9.0 12和15 x10⁸(图4)。这些标准主要用于将细菌悬液调整到标准化细菌测试的给定范围内，如通过测量最小抑菌浓度(MIC)进行抗生素敏感性测试。在这些测试中，如果使用的悬浮液太重或太稀，就可能出现任何给定抗菌素的错误结果(要么是错误的耐药，要么是错误的易感)。
浊度标准用于调整不同仪器之间的测量，而不是估计细胞浓度。浊度法也是基于微生物的光散射，但与OD相反₆₀₀测量由于散射造成的传输损失时，散射比浊法直接检测与光源成一定角度的散射光，而不是直接在散射光的路径上，只有衍射光才会到达探测器。比浊度标准福尔马津，是由硫酸肼和六亚甲基四胺在水中反应而成，形成一种难溶的悬浮液^[13]．根据反应的化学计量，用定义的浊度单位(NTU)产生特定数量的浊度。这些市售胶体溶液可用于比较两种分光光度计的结果。如前所述，当测量同一样品的散射光时，两台仪器之间不同的光学排列会产生不同的OD结果。

讨论

一个典型的误解是，在600nm或接近600nm时OD的变化是细菌吸光度的量度。这个值，通常称为A₆₀₀或OD₆₀₀真的是散射光和吸收光的结合。因为大多数细菌培养物不强烈吸收可见光，探测器上的变化主要是光散射，特别是当粒子(如细菌细胞)的大小接近可见光波长时^[14]．

一个OD₆₀₀测量取决于所使用的仪器配置的类型，并且在不同微生物之间进行比较时也有所不同。例如，较大的生物往往比较小的生物散射更多的光(酵母vs.细菌)，光路的微小差异会产生不同的测量结果。使用适当的测量技术可使用户产生不同仪器配置之间具有可比性的结果，并可信赖地将其作为一种可重复的方法来确定特定过程。科学家们通常依赖于发表的OD₆₀₀在实验过程中采取不同行动的数据。由于与所使用的仪器和所表征的过程有关的所有变量很少为人所知，因此建议使用与OD有关的生长曲线来确定经验浓度测量₆₀₀针对任何特定细胞类型的板计数值。

为了重复性的结果，重要的是总是使用相同的光度计重复的外径₆₀₀实验。尽管如此，当使用相同的光度计时，一些因素仍然影响每次测量，当使用相同的光度计，浊度测量的结果差异很大时，必须考虑到这些因素。OD的校准通常随生长条件和细胞大小的变化而变化。当培养物的生长速度开始减慢时，许多生物体将在更大程度上生长，而不是分裂和增加数量。同样，生长介质的折射率随时间的推移也会发生变化。例如，细胞裂解可以引入膜脂，它可以作为表面活性剂。在生长混合物中添加糖等补剂，除了促进微生物生长外，还可以改变折射率。

监测微生物生长在微生物板阅读器需要两个参数严格控制:温度和曝气。微生物生长的最佳温度各不相同，但酵母通常在30°C左右，许多细菌则在37°C左右。LogPhase™600微生物学阅读器提供30°到45°C的温度控制，增量1°。此外，可以应用轻微的温度梯度(软件可选)，使微微板的顶部比底部略热，防止盖子或板密封内部凝结，这将导致异常的结果。对于曝气，设定最佳参数可能更具挑战性。细菌生长需要曝气，因为氧气通常不能很好地溶解在液体中。
因此，除非氧气可以直接供应到培养物中，最好的方式是通过摇动微板来提供空气。LogPhase 600提供轨道振动，在转速和振幅方面进行了优化，以确保悬浮培养保持悬浮状态^[15]．

参考文献

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