斑马鱼眼部结构的全挂载免疫荧光成像

使用安捷伦BioTek Cytation C10共聚焦成像阅读器进行稳健的自动共聚焦成像2022世界杯附加赛决赛

作者: Rebecca Mongeon博士安捷伦科技有限公司

摘要

全体荧光免疫组化是斑马鱼模型系统中基于显微镜的表型分析的主要方法。在本研究中，荧光免疫组化和染色相结合的方法检测了胚胎斑马鱼的眼睛结构。为了进行比较，使用Agilent BioTek在宽视场和共聚焦成像模式下对样本进行了研究2022世界杯附加赛决赛2022世界杯32强赛程表时间 共焦成像阅读器。结果表明，使用Cytation C10的共聚焦光学处理来自较厚样品中更深的荧光信号的好处。清晰，详细，高质量的共聚焦图像的整个斑马鱼胚胎标记使用荧光免疫组化。

简介

斑马鱼由于其与人类眼部发育的相似性，长期以来一直在眼睛发育生物学研究中发挥着重要作用。¹随着基因操作技术的不断扩展，斑马鱼已经被证明是研究人类眼科疾病的一个显著的模型系统，包括青光眼和白内障等晚发性疾病。²光学显微镜技术对于这些研究是至关重要的，其中荧光免疫组化是眼睛和视网膜表型分析的基本工具。

在胚胎阶段，斑马鱼由于其体积小和光学透明度，适用于全装免疫组化方法。然而，传统的宽视场显微镜方法在成像深度超过几微米厚样品时是有限的。共聚焦成像可以克服这些限制，并提供了一种方法来检查斑马鱼胚胎更深层次的荧光信号。但是，考虑到大多数共聚焦显微镜的巨大成本和专业性，研究人员经常依赖组织切片和重建方法来产生高质量的图像。^3.安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek2022世界杯32强赛程表时间 共聚焦成像仪消除了这些障碍，允许更多的实验室获得强大的，自动化的共聚焦成像。

在本研究中，利用Cytation C10仪器的共聚焦模式，通过荧光全装免疫组化来检查胚胎斑马鱼的眼睛。为了突出为斑马鱼研究的自动成像系统增加共聚焦能力的好处，在Cytation C10上使用传统的宽视场模式对相同的结构进行了成像。

实验

化学物质

除非另有说明，所有化学品均来自Sigma Aldrich(圣路易斯，密苏里州，美国)。

样品制备

斑马鱼的一般养护遵循既定的方法。⁴野生型雄性和雌性鲐鱼类保持在28°C，光照/黑暗周期14至10小时。成虫杂交，卵及时收集于EM3培养基中。⁵为了减少色素沉着，胚胎在受精后24小时开始用0.003%的苯基硫脲在EM3中处理。

免疫组织化学

用以下步骤制备胚胎进行免疫组化和染色。受精后3天(胸鳍期)，人工去层膜，麻醉胚胎，用4%多聚甲醛(PFA)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中4℃固定过夜。孵育后，从PFA中取出固定胚胎，用含1%聚山梨酸酯20 (PBST)的PBS冲洗。胚胎渗透依次进行:固定胚胎在超纯水(水)中冲洗，在-20°C预冷冻丙酮中浸泡8分钟，用水冲洗，最后在PBST中冲洗。然后胚胎在室温下(RT)在渗透缓冲液(PBST含3% Triton X-100和1%二甲亚基亚(DMSO))中孵育1小时，然后在RT中在阻断缓冲液(PBST含3%牛血清白蛋白(BSA)、1% Triton X-100和1% DMSO)中孵育1小时。渗透和阻塞的胚胎在4°C下在一抗和1:200 DAPI (Invitrogen D1306)、1:100 phalloidin-Alexa488 (Invitrogen A12379)和1:100抗乙酰化微管蛋白(Sigma SAB5600134)的染色混合物中孵育过夜。孵育后，将胚胎大量冲洗，并在PBST的RT中孵育3小时。然后用二抗(抗兔Alexa647, Cell Signaling 4414S)在4°C下孵育胚胎过夜，然后用PBST大量冲洗。胚胎转移到载玻片上的安装介质(80%甘油，20 mM TRIS pH 8.0, 0.05%没食子酸丙酯)，并通过#1.5玻璃盖片成像。

仪表

的2022世界杯32强赛程表时间 共焦成像阅读器和安捷伦BioTek2022世界杯附加赛决赛Gen5使用Microplate阅读器和成像软件获取所有图像，包括亮场、宽场和共聚焦图像。Cytation C10仪器配备了一个40微米的针孔旋转盘，Hammamatsu Orca sCMOS相机，以及用于共聚焦和宽视场模式的发射/激发滤波器立方体。所使用的成像滤波立方体包括:宽场:DAPI 1225100, GFP 1225101, CY5 1225105;共聚焦:DAPI 1945103, GFP 1945104, CY5 1945102。

成像程序及处理

所有20倍放大图像以2µm间隔的z系列获得，包括宽视场和共聚焦模态。所有40倍放大图像以1µm间隔的z系列获得，包括宽视场和共聚焦模态。图像处理使用Gen5软件用滚动球算法在所有荧光通道中使用30 μ m直径来压平背景。使用Gen5软件“Maximum”方法对z投影进行求和。然后使用缺省的Gen5计算点扩散函数参数对最大的zprojection图像进行反卷积。计算样品折射率错配的光学深度估计使用轴向畸变校正因子确定。⁶

结果与讨论

为了使用荧光成像对颅骨结构进行一般检查，我们使用了核染色(DAPI)、细胞骨架染色(phalloidin)和细胞骨架免疫组化(抗乙酰化微管蛋白)。将受精后3天的胚胎置于背外侧位置(图1A)，可以在20倍放大的单视场下在C10细胞上获得整个头部的全景图像(图1B)。

图1B(左面板)所示的亮场图像是在距离头部背表面约240微米的光学深度的单个焦平面上拍摄的。在这个位置，眼睛在横切面上可见，视网膜分层可见。利用Cytation C10的宽视场和共聚焦模块自动采集z系列荧光图像。所捕获的z-堆叠的投影(图1B，中间和右侧面板)表示约60微米厚的部分。尽管z-stack光学成像深度距离头部背表面约240 μ m，但由于头部的几何形状，大部分信号来自穿过更少组织的光。

共焦图像(图1B，上一行)与宽视场模式(图1B，下一行)相比，显着减少了失焦背景光。当比较在共焦和宽视场模式下获得的处理图像z-堆栈时，这种背景的减少是值得赞赏的(图1B，右)。像晶状体纤维这样的结构(图1B，箭头)在共聚焦图像中清晰可见，但在宽视场图像中无法与背景区分开。

图1所示。安捷伦BioTek Cytation C10共聚焦成像阅读器共聚焦和宽视场模式下三天龄斑马鱼胚胎头部的背腹侧全贴装图像。2022世界杯附加赛决赛(A)成像平面示意图(虚线)及胚胎方位。(B)在20倍放大倍率下，在宽视场和共聚焦模态下以z系列捕捉斑马鱼头部。在安捷伦BioTek Gen5软件中，在单个平面上拍摄的Brightfield图像与z投影图像(~60微米厚的部分)、之前(“Raw”)和之后的背景缩减处理一起显示。2022世界杯附加赛决赛蓝色通道对应DAPI核染色，绿色通道对应肌动蛋白phalloidin染色，红色通道对应神经元轴突乙酰-α-微管蛋白免疫染色。箭头表示共焦图像中可见的晶状体纤维。比例尺表示200µm。

通过横向安装，将胚胎旋转90度(图2A)，可以在40倍放大倍率下在Cytation C10上对斑马鱼眼睛进行单视场成像。与整个头部一样，在同一台仪器上以共焦(图2B，上行)和广角(图2B，下行)模式以z系列方式拍摄眼睛图像。图2B中所示的z-投影包含从眼睛表面开始约35µm的~20µm光学深度部分。为了在这些图像中包含完整的前极晶状体结构，绿色通道z-投影包含了额外的z切片。这些z切片从眼表面开始，因此绿色通道包括更大的总光学深度部分(~55µm)。

为了清晰起见，每个成像通道单独显示，然后作为最终的合成图像显示(图2B)。核DAPI染色(蓝色)显示视网膜核层，如标签所示。phalloidin染色(绿色)显示丛状层和晶状体纤维结构。乙酰化α-微管蛋白染色(红色)显示视网膜各处的神经元轴突，突出显示视网膜细胞层之间的连接。

与宽视场模式相比，共焦模式所提供的图像质量的改善是显而易见的。共聚焦图像区分了DAPI通道中的单个核，phalloidin通道中的晶状体纤维，以及遍布视网膜的大量精细神经元轴突。这种级别的细节在广角模式下是不可见的。

图2。安捷伦BioTek Cytation C10共聚焦成像读取器共聚焦和宽视场模式下3天大的斑马鱼胚胎眼睛的横向全贴装图像。2022世界杯附加赛决赛(A)成像平面示意图(虚线)及胚胎方位。(B)在40倍放大倍率下，在共聚焦和宽视场成像方式的z系列投影图像中捕获斑马鱼眼睛。缩写:ONL，外核层;INL，内核层;神经节细胞层;OLM，外限制膜;OPL，外丛状层;IPL，内丛状层。

图2B所示的40倍图像的数字变焦突出了只能在共聚焦成像方式下观察到的透镜结构(图3)。Phalloidin染色了透镜纤维细胞骨架中的肌动蛋白丝。随着晶状体细胞的分化和成熟，细胞骨架被排除在细胞质之外，并与细胞外围的质膜紧密结合。在横切面上，晶状体纤维细胞呈细长的六边形，两个宽边和几个窄边紧密并列，这导致在狭窄的侧边观察到强烈的阴茎素染色。⁷在图3所示的靠近晶状体赤道的单z型切片中，phalloidin染色显示了晶状体外皮层晶状体细胞的窄侧和宽侧。在整个晶状体前极的z型投影中，窄边缘染色表现为条纹，突出纤维细胞边界，因为它们在前缝处汇聚。用phalloidin标记的晶状体上皮细胞也可见为覆盖在纤维细胞条纹上的外单层六角形图案。

图3。在Agilent BioTek Cytation C10共聚焦成像阅读器上共聚焦模式下获得的三天大的斑马鱼胚胎晶状体的横向整体安装图像。2022世界杯附加赛决赛在40倍放大和数字变焦下，斑马鱼透镜结构显示在单个光学平面(左)和z系列投影(右)中。DAPI核染色(蓝色)为细胞核，包括晶状体上皮细胞单层。肌动蛋白丝的Phalloidin染色(绿色)突出晶状体纤维细胞边缘。缩写:IPL，内丛状层;神经节细胞层。

结论

安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek Cytation C10共聚焦成像阅读器为Cytation仪器系列增加了共聚焦光学，而不影响自动Cytation成像系统的多模态功能和易用性。共聚焦光学使使用荧光免疫组化标记的斑马鱼胚胎的高质量成像成为可能。通过与宽视场成像的比较，本应用笔记证明了Cytation C10旋转圆盘共聚焦的光学切片能力对于准确捕获斑马鱼胚胎深处的荧光标记细胞结构至关重要，从而能够对斑马鱼眼科研究的视网膜和晶状体结构进行详细评估。

参考文献

1. 理查森,r;Tracey-White d;韦伯斯特,a;斑马鱼的眼睛——研究人类眼部遗传学的范例。眼科2017,31(1)，68-86。doi: 10.1038 / eye.2016.198
2. Chhetri, j .;雅各布森,g;斑马鱼——朝着眼科研究的方向前进。眼科，2014,28(4)，367-380。doi: 10.1038 / eye.2014.19
3. Oralova诉;罗莎，j.t.;Soenens m;贝克，J. W.;Willaert, a;威腾，体育;超越全装表型:斑马鱼荧光应用中的高分辨率成像。生物公开赛2019,8(5)，bio042374。doi: 10.1242 / bio.042374
4. 关于斑马鱼的书:实验室使用斑马鱼(Danio rerio)的指南。第4版，尤金:俄勒冈大学出版社，2000年。访问地址:https://zfin.org/zf_info/ zfbook/zfbk.html
5. Avdesh, a;陈,m;Martin-Iverson M.T.;Mondal, a;Ong g;Rainey-Smith,美国;塔代伊k;Lardelli m;增长,D.M.;Verdile g; Martins, R.N. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp 2012, 69:e4196. doi:10.3791/4196
6. 一昼夜的一些;李奇曼J.W.;教程:避免和纠正三维荧光显微镜中样品诱导的球差伪影。Nat Protoc 2020, 15, 2773-2784。doi: 10.1038 / s41596 - 020 - 0360 - 2
7. Vorontsova i;大厅,j .;斑马鱼晶状体核定位和缝合完整性的评估。J Vis Exp 2019, 47:e59528。doi: 10.3791/59528。