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多功能、低成本的禽流感和鸡链球菌支原体elisa试剂盒的自动化

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2010年1月28日

作者:Wendy Goodrich, BioTek Instruments, Inc.的应用科学家;PAS技术服务代表马特·杜金IDEXX实验室

爱德xx实验室标志

摘要

高致病性禽流感(AI)亚型是导致家禽和家禽大量死亡的病毒，就H5N1亚型而言，可感染人类，有可能引发全球流感大流行。鸡毒滑膜支原体(Mg/Ms)感染也在家禽群体中迅速传播，造成生产和存栏量的广泛损失。为了确保全球农业经济的健康发展和最大限度地减少全球流感大流行的可能性，对定期检测家禽和牲畜样本的实验室提出了越来越高的要求。设计计划良好的分析通量模型的两个最大挑战是管理大多数自动化在许多标准ELISA筛选试剂盒提供的试剂量范围内消耗的液体过剩，以及在检测步骤的培养窗口内以最佳数量处理批次。使用BioTek设计了一个实验EL406组合清洗机/分配器展示了工作流程的通用性和具有成本效益的试剂使用，使用两种不同的吞吐量模型，一个使用IDEXX支原体鸡毒滑膜菌ELISA间接格式试剂盒，另一个使用IDEXX禽流感多物种ELISA阻断格式试剂盒。由少于5个板的多次运行组成的小批模型和集成了BioStackTMMicroplate stack用于运行5个或更多的板批次，证明可靠的，可重复的结果与预期水平的批间和批内可变性的两种测定，同时提供通用性的工作流，优化吞吐量和试剂的使用。

简介

设计有效的自动化检测工作流程是许多实验室面临的挑战。要获得良好的吞吐量可能会有许多障碍。例如，当优化仪器使用的试剂量时，重要的是要保存试剂，特别是目标特定的试剂，可能生产成本高，可能不提供个人购买。这带来了一个重要的工作流程问题，因为将自动化所需的试剂过量或“死”体积添加到处理检测所需的实际体积中，可能会比试剂盒中提供的最小所需试剂的总体积大。

严格定义的孵育步骤，包括指定的时间和温度窗口是ELISA试剂盒的典型规范。超出规格的可变孵育时间可能是导致微板内和微板间检测性能下降的一个重要因素。试剂盒规定的最短培养时间通常会限制在批处理中可以有效处理的板的总数，而不会引入检测信号在板与板之间漂移的可能性。将定义的孵化窗口无缝集成到工作流中可以避免这些潜在的问题。

仅使用BioTek EL406组合洗涤分配器和可选的BioStack微板堆垛机，为两种不同的IDEXX试验设计了两种不同的吞吐量模型，显示了这些仪器的灵活性，可处理小批量的单个板到多个批次，每天可以处理20或更多的板。这是在必要的检测培养窗口内完成的;不需要任何额外的试剂，缓冲液或消耗品，除了标签和试剂盒提供的;并且不需要任何定制的仪器配件。本实验使用的ELISA检测试剂盒演示了如何用最小的自动化投资就能产生高性价比的工作流程的多功能性。该仪器的功能允许多种分析处理组合，使这些通用的半自动方法的许多固有原则适用于各种实验室设置。

材料与方法

IDEXX实验室提供了鸡毒滑膜支原体(Mg/Ms)和禽流感多种(AI多种)五(5)板试剂盒，以及两批预稀释的试验血清。AI MulitS提供阴性血清，Mg/Ms提供阳性血清。每板重复92份试验血清。为了验证两个试剂盒的检测结果，每个平板的其他四个孔包含2个阴性对照和2个阳性对照的重复。

根据包装插入的要求，在96孔包覆了各自抗原的微板上进行检测。将测试样品在被膜孔中孵育，使抗原-抗体复合物形成。洗步去除孔中未结合的物质，并添加共轭物。在第二个孵育步骤中，偶联物与孔中任何附着的抗体结合(Mg/Ms)，或在没有抗体的情况下直接与抗原结合(AI multiple)。除去未结合的共轭物，加入酶底物。在衬底孵育之后，在孔中加入停止溶液，在650纳米处读取板。颜色的发展与测试样品中存在的Mg/Ms抗体的数量直接相关，或与测试样品中抗ai抗体的数量成反比。

实验总结

实验分两个阶段进行。第一阶段的目标是确定仪器功能和所提供的组件之间的潜在吞吐量限制和分析的处理要求。然后，设计模拟来确定可以衡量分析处理和仪器接口成功的工作流程。在将模拟的结果合并到最终的工作流中之后，实验的第二阶段是使用每个吞吐量模型运行测试。

第一个模拟是通过使用Mg/Ms试剂盒来确定小于5个板的小批量的最佳工作流程。该试剂盒自动化工作流程的主要挑战是标记共轭体积提供50毫升，这是分配100 μ L每孔所有96孔的5个板。为了在这个体积下有效地自动化检测，所有试剂必须在任何批次运行后保存，包括仪器启动后试剂槽中剩余的体积。设计了一个模拟来比较使用50毫升蓝色染料的EL406分配到5个板与使用相同体积和溶液的两个单独批次的手动分配到5个板。步骤1到7描述了模拟。表1和表2所示的结果显示了两种配药方法之间的比较性能。

  1. 一个空的96孔微板被用来削一个分析天平。
  2. 将50ml蓝色染料溶液添加到康宁50ml试剂库中，再将50ml相同溶液添加到一个50ml锥形圆筒中，用于EL406。
  3. 接下来的初始步骤(仅对EL406上的1号板和2号板进行)使用5µL的蠕动泵盒将100µL的染料分配到第一个96孔微板上的每孔。用多通道移液器反向移液，手动将试剂库中100 μ L的染料分配到另一个96孔微板中。
  4. 两个盘子都称重了。
  5. 两个平板均在630纳米处读取。
  6. EL406上剩余的试剂被清除回试剂容器中进行测量。测定手工法的剩余试剂。
  7. 对其余的板重复步骤3到5，在读取最后一个板后重复步骤6。

Mg/Ms工作流模拟试剂回收率结果百分比
表格1.Mg/Ms工作流模拟试剂回收率结果百分比

Mg/Ms工作流模拟的精度和精度结果
表2．Mg/Ms工作流模拟的精度和精度结果

AI MultiS试剂盒的吞吐量限制因素是最后15分钟的孵育和检测缓冲体积。实验处理模拟测试了在AI MS实验的60-30-15孵育时间内使用BioStack依次处理5个板的时间要求，并确定了最低的最佳缓冲液启动量，以便在连续批次运行中保留足够的缓冲液舒适地完成所有5个板。在这种情况下，两个注射泵分配器与蠕动泵分配器盒相结合，提供了一个非常适合的分配器配置，以满足更大的吞吐量，需要立即进行检测处理，因为不需要用户干预更换试剂，软件可以在检测处理过程中访问任何分配器，并且可以对清洗步骤进行编程，自动与分配器步骤集成。模拟结果被纳入延迟和缓冲启动值，如图1所示的最终液体处理控制™程序所示。

模拟成功后，准备进行试验。如图2所示，小批模型运行了两次，第一次作为一个单板以证明数据与模拟运行相媲美，然后作为一个4板批次以证明在板处理步骤之间的最短延迟内可以完成试剂之间的盒的更改。所有三个分配器盒的吸气管被直接放置到各自的试剂盒试剂容器中，剩余的试剂在分配器之后被清除回试剂容器中，然后加载下一个盒。每个试剂都有一个专用的盒，不仅可以优化试剂的使用，使用一个5µL盒来减少引物体积，但它提供了减少污染或任何Mg/Ms试剂之间的携带的附加优势。

LHC集成BioStack和EL406执行禽流感多物种试验的吞吐量模型2。
图1．LHC集成BioStack和EL406执行禽流感多物种试验的吞吐量模型2。

吞吐量模型2，如图3所示，旨在提供AI MultiS套件的所有5个板的自动化处理，但也可以用于运行单个或更小的批次，无论是否使用BioStack。
在制备冲洗缓冲液后，将EL406装上10µL的蠕动泵盒(5µL的蠕动泵盒也可以兼容)，并将抽吸管浸泡在随试剂盒提供的共轭试剂容器中。将注射器A和B吸入管分别浸入TMB和Stop试剂容器中。最后的LHC分析程序集成BioStack需要3 - 3.5分钟来完成对照和样品分配到每个板。这可以通过将对照物和样品加载到未包被的微板上，然后使用8通道移液器将样品分配到包被的分析板上，每个柱之间的尖端变化。然后将这些盘子按数字顺序装入BioStack 30个盘子的支架中(盘子1在底部，盘子5在顶部)。LHC程序启动，2小时6分钟后，在测试结束时取出钢板。使用BioTek Synergy™HT微板阅读器上的单色仪在650 nm下读取每个板，生成结果。

试验验证结果

表3和表4说明了试验验证和样品解释的结果。所有的计算都是在平均OD (650nm)上进行的。本试验样本分别为92个Mg/Ms已知阳性检测血清和92个AI multiple已知阴性检测血清。数据表明，所有的板都在定义的验证标准为两种分析。表3和表4提供的数据也显示了检测性能与IDEXX提供的比较QC数据的高度相关性(未显示)。

吞吐量模型1
图2．吞吐量模型1

吞吐量模型2
图3．吞吐量模型2

表格
*S/P比率= (SMP;x - NC;x) / (PC;x - NC;x)

表3．Mg/Ms测定结果的验证与解释。

人工智能的试验验证和结果解释
*信噪比= SMP;x / NC

表4．人工智能的试验验证和结果解释
多年代。

数据分析

从每个井组的平均吸光度结果的相关性可以看出，图4展示了使用吞吐量模型1进行Mg/Ms测试的所有5个板的批间和批内重复性。

．平板Mg/Ms测定结果。
图4．平板Mg/Ms测定结果。

综合测试血清CV%的所有板的吞吐量模型1和2。
数字5.综合测试血清CV%的所有板的吞吐量模型1和2。

图5显示，两种测定方法的所有培养皿的血清CV%值都在2.5%的变异窗口内，所有培养皿的平均CV%为6.12%。导致井间变化的因素包括垫圈性能、塑料变化、分析仪变化和化验变化。这些测定的可接受CV% < 10%。

图6显示了使用集成生物堆栈的禽流感多物种试验的5个板之间所有数据的紧密相关性，以演示吞吐量模型2的可行性。

禽流感多物种平板分析结果。
图6．禽流感多物种平板分析结果。

结论

有效的自动化工作流设计原则对任何应用程序都是通用的。这些原则中的一些被纳入到这项工作中，以解决典型的工作流挑战，并可以很容易地适用于其他吞吐量模型:

  1. 通过了解与检测要求相关的仪器可能的吞吐量限制，查找工作流中的潜在瓶颈。在IDEXX Mg/Ms和AI MultiS试剂盒中，使用指定的自动化设备需要解决的两个最大挑战是测定的标记试剂数量和孵育规范。
  2. 在使用分析工作流“上线”之前，执行模拟吞吐量模型。调度的验证与仪器上检测性能的验证同样重要。

EL406是一种多功能的组合洗涤和分配器，可为各种吞吐量实现可重复的批间和批内结果，包括附加BioStack Microplate堆栈的离场检测处理。EL406增强了工作流程选项，通过结合使用几乎没有消耗品的多个检测处理任务，提供了许多可选的设置，以帮助优化试剂的使用和培养窗口，提供灵活的软件，允许各种批次模型的最佳调度，并减少了多个单一使用仪器的日常维护所需的停机时间。EL406与IDEXX Mg/Ms和AI multiple ELISA筛选分析合作的工作流程演示只是多功能EL406如何提供可适应各种实验室设置的吞吐量解决方案的一个例子。

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