单步闪光和双光谱荧光素酶报告基因分析的验证和比较使用Synergy™系列的微板阅读器

相关示例文件:双重Luc H4


作者: Peter J. Brescia和Peter Banks, BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT;D.E.休斯，J. Narahari, J. Choi, G. Los, A. Deshpande和B. Webb，热费希尔科学罗克福德,IL)

简介

长期以来，报告分析一直被用于研究基因表达在各种生物中对环境刺激的反应的调控机制。报告基因构建依赖于在报告基因上游插入遗传调控元件，然后将构建(通常是质粒)插入目标细胞或生物体(图1)。

图1。Thermo Scientific™pmcs - gauss Luc报告结构。感兴趣的调控元件可以插入到Luc报告基因上游的多个克隆位点(MCS)。在培养中使用嘌呤霉素或氨苄青霉素可施加选择性压力。

基于荧光素酶的报告结构的引入提供了一种新的信号检测方法，光的酶促产生(发光)，导致在广泛的实验条件下几乎没有背景干扰¹．在荧光素酶报告分析中，荧光素酶的表达是由调控元件驱动的，对发光信号的测量可以量化影响所研究信号通路的因素的活性(图2)。²．

图2。荧光素酶报告试验的示意图。

在过去的几十年里，人们发现了各种各样的荧光素酶变体;许多变体需要一套独特的基材和辅助因子，而其他的则不需要。更重要的是，产生的光在稳定性、亮度和发射光谱方面可以有所不同²．多种形式的荧光素酶的出现自然使其能够以多路复用的方式利用多种报告结构进行检测。通常双报告者分析结合了在单个生物体或细胞中使用两种不同的荧光素酶;其中一个用于研究实验参数(实验报告器)，另一个用于测量转染效率、细胞活力和实验归一化细胞电镀精度的内部控制(归一化报告器)。²．

在这里，我们研究了一种新型双荧光素酶检测的性能，使用两种荧光素酶在96孔或384孔密度微板中光谱可分辨的光发射，分别使用Thermo Scientific高斯-萤火虫荧光素酶双检测或高斯和Renilla荧光素酶闪光检测试剂盒。进行了分析优化，并比较了几种BioTek的分析性能协同™多模式微板阅读器配置有注射使用裂解物含有表达的荧光素酶。

材料和方法

荧光素酶Flash化验

Renilla和Gaussia荧光素酶快速检测试剂盒(Cat。# 16165和16159)和表达Renilla或Gaussia荧光素酶的细胞裂解物和缺乏荧光素酶酶的对照细胞裂解物是来自Thermo Fisher科学公司(Rockford, IL)蛋白质生物学部门的礼物。在固体，白色384孔微板(Cat。# 3705,康宁公司。生命科学，图克斯伯里，马萨诸塞州)。根据制造商的建议进行了以下修改，以便在384孔微孔板格式中使用。简单地说，100x腔肠嗪库存被aliquote和存储在-80°C避光。使用当天将原液稀释50 μL到5 mL适当的快速测定缓冲液中制备1倍腔肠嗪工作溶液。为了优化解读器设置，细胞裂解液在细胞裂解缓冲液中被稀释1倍、1000倍(E-3x)或10,000倍(E-5x)。细胞裂解物也经过11点半对数稀释序列进入裂解缓冲液中，包括仅由裂解缓冲液组成的对照。 For all assays, the microplate reader injectors were primed with 1.2 mL of working solution just prior to performing the assay. Each assay well containing 5 μL of cell lysate or lysis buffer alone received 25 μL of working solution using the microplate reader injectors immediately before detection of light output. The assay protocol was run in well-mode from the Gen5™ Data Analysis Software (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT) with the parameters outlined in Table 1 and data exported to either Microsoft Excel (Redmond, WA) or GraphPad Prism (La Jolla, CA) for analysis.

高斯-萤火虫荧光素酶双检测

高斯萤光素酶双检测试剂盒(Cat。#16182)和表达Gaussia或Firefly荧光素酶的细胞裂解物或缺乏荧光素酶酶的对照细胞裂解物是来自赛默飞世尔科学公司(Rockford, IL)的礼物。在固体，白色96孔微板(Cat。# 3912,康宁公司。生命科学，图克斯伯里，马萨诸塞州)。根据制造商的建议，对96孔微孔板格式的使用进行了以下修改。简单地说，将冻干的d -荧光素颗粒重悬在适当体积的高斯-萤火虫双分析缓冲液(0.5 mL)中，得到100倍的存量。

100x的库存被aliquote和存储在-20°C避光。如上所述制备腔肠嗪原液。将50 μL重组d -荧光素原液和50 μL腔肠嗪原液稀释成5 mL高斯-萤火虫双分析缓冲液制备工作溶液。将高斯荧光素酶细胞裂解液在裂解缓冲液中进行半对数稀释序列，包括由裂解缓冲液单独组成的对照。萤火虫荧光素酶细胞裂解液被稀释2倍作为内部对照。按1:1 (v/v)比例与萤火虫荧光素酶裂解液混合，总体积为20 μL。在进行测定之前，用1.2 mL的工作溶液填充microplate reader注射器。每个含有20 μL细胞裂解液或裂解缓冲液的测定孔，在检测光输出前立即使用微板读取器注入50 μL工作溶液。按照上述方法运行和分析该试验方案。

表1。读者参数。A) 96孔格式荧光素酶闪光测定所用的读取器参数;B)每个分析格式的优化读取高度;C)用于384孔格式双荧光素酶分析的读取器参数。

结果与讨论

光学探针高度(从微孔板到仪器光学的距离)可以对信号与背景比有相当大的影响，这变得越来越重要，因为在高密度微孔板格式中，检测体积变小了。用细胞裂解液中高表达的荧光素酶快速检测产生的信号在足够长的时间内是稳定的，以确定每个读取器的最佳探针高度。在Synergy H1和Synergy Neo上使用Gen5软件中的读取高度自动调整功能对探头z高度进行优化(图3)，分别在9.25和8.25 mm高度处获得了最佳的信号灵敏度。Synergy H4 Z-height通过手动方法(数据未显示)优化，在连续的读取步骤中增加读取高度。结果表明，最小探针高度为1 mm时灵敏度最高。

图3。自动化Z-height优化。来自Thermo Scientific高斯荧光素酶闪光试验的代表性数据显示信号强度曲线作为探针z -高度的函数，在384孔密度微板中进行测定，读数为a) Synergy H1和B) Synergy Neo。

一旦确定，最佳探针z高度用于确定最佳信号检测的适当增益设置，并考虑不同荧光素酶变体之间的表达水平和信号强度的可变性。最佳增益设置被确定为导致最佳S/B比，同时确保信号强度保持在未稀释细胞裂解液(1x)的光电倍增管(PMT)饱和阈值(溢出)以下。96井和384井的微板密度都重复了这一过程。

荧光素酶Flash化验

采用半对数稀释方案对Renilla和Gaussia荧光素酶裂解物进行稀释，并使用表1所示的优化的阅读器参数来研究阅读器的性能。所有三种仪器的读取参数几乎相同，除了探针高度和更短的集成时间0.2秒用于HTS仪器，Synergy Neo。数据以log-log形式绘制，y轴为相对发光单位，x轴为折叠稀释度。在GraphPad Prism软件中使用对数-对数非线性回归分析分析数据，以研究相对线性度(图4)。很明显，包含表达Renilla Luciferase的裂解液(图4A)在所有测试的阅读器中显示了良好的线性度，动态范围跨越50年。高斯荧光素酶表现出令人满意的线性，尽管Synergy H1在稀释序列的最后30年有一些额外的信号可变性。

图4。雷尼拉和高斯荧光素酶闪光试验。A) Renilla和B) gaussian荧光素酶裂解物在裂解缓冲液中进行半对数滴定。数据显示为发光信号(rlu)与跨越五个数量级的动态范围的折叠稀释。

高斯-萤火虫荧光素酶双检测

荧光素酶双重测定法依赖于光谱分辨一对产生不同波长光的不同荧光素酶的能力。双光谱荧光素酶报告基因检测的一个典型应用允许同时监测来自报告质粒和第二个荧光素酶对照质粒的荧光素酶活性，提供了一种规范井间变异的方法。虽然可以光谱分辨任意数量的荧光素酶，但高斯荧光素酶和红萤火虫荧光素酶的光谱重叠很少(图5)。通过仔细选择适当的滤波器，在添加包含适当辅因子和底物的一步检测试剂后，根据读取器的能力，可以依次或同时读取每个变体的信号。如图6所示，推荐的滤波器范围是用于高斯光输出的485±20 nm带通(BP)滤波器和用于红萤火虫输出的640 nm长通(LP)滤波器，以确保最小的光交叉。

图5。高斯萤火虫双荧光素酶发射光谱谱图。阴影区域代表高斯荧光素酶和红萤火虫荧光素酶的推荐过滤范围，λmax分别为485 nm和613 nm。

一个典型的双光谱荧光素酶报告物检测方案总结如下(图6)。为了模拟检测条件，如化合物的抑制剂量反应，将高斯菌裂解液(实验报告物)稀释，并将1:1 (v/v)添加到如上所述的恒定浓度的红萤火虫裂解液(归一化对照)中。通过单一试剂注射开始检测，并在Synergy H1和H4上顺序读取双发光信号，或同时使用Synergy Neo的双发射检测功能。

图6。热科学高斯-萤火虫荧光素酶双检测试剂盒的协议摘要。这是光谱分解两个荧光素酶的一步程序。通过将两种底物包括在一个检测试剂中，两种荧光素酶活性可以通过基于过滤的检测在样品中同时测定。

很明显，在所有阅读器上测试的浓度范围内，无论高斯荧光素酶浓度如何，红色萤火虫荧光素酶信号都表现出良好的线性关系(图7)。上文讨论的高斯荧光素酶趋势再次得到证实。

图7。高斯萤光素酶双检测。高斯萤光素酶双检测试剂盒用于测定各种Synergy读本上每个报告蛋白的活性。该试验是模仿典型的双报告试验的单步试验。A) Synergy H4 B) Synergy H1和C) Synergy Neo。

结论

基于荧光素erase的报告分析在基于细胞的分析中继续发挥着重要作用，提供了一种研究复杂信号事件的高灵敏度方法。多重荧光素酶变异的能力允许通过监测细胞活力，转染效率和电镀可变性的数据规范化。在这里，我们展示了在一系列Synergy微板阅读器上成功执行基于Pierce荧光素酶的分析的能力，并在几种微板格式中获得了类似的结果。此外，我们还展示了通过光谱可解析荧光素酶的顺序读取或利用Synergy Neo及其多个并行检测器的优势进行荧光素酶双检测的能力。还描述了最佳的读取器设置和过滤器设置，从而能够检测超过5个数量级的荧光素酶浓度。

参考文献

1. Williams™，Burlein JE, Ogden S, Kricka LJ, Kant JA。(1989)。“萤火虫荧光素酶作为报告基因的优势:应用于白细胞介素-2基因启动子”。生物化学学报176(1):28-32。
2. “荧光素酶记者选择指南”，Pierce.com, N.p, n.d.web, 2013年8月14日。