紫外荧光偏振作为研究蛋白质构象和质量变化的一种手段-利用本征色氨酸荧光结合紫外偏振器

作者: Paul Held博士和Kyle Davis，应用部门，BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT

必需氨基酸色氨酸在紫外光谱的激发下具有本质荧光性。这种物理特性可以用来研究含有这种氨基酸的肽和蛋白质。在这里，我们描述了使用Synergy H1阅读器与uv荧光偏振器一起研究溶液中蛋白质的构象和质量变化。

简介

荧光偏振(FP)是一种基于观察荧光分子在受到平面偏振光激发时发出平面偏振光的荧光探测技术。在溶液中，蛋白质可以自由旋转，因此发射的偏振光平面可以根据荧光团的荧光寿命和分子在这段时间内的旋转程度而改变。分子转速受溶液粘度、绝对温度、分子体积和气体常数的影响。如果保持黏度和温度不变，那么影响转速差异的关键变量是分子体积，或者近似为分子量。

荧光偏振(FP)测量是用两个不同的偏振滤波器进行的，这两个偏振滤波器平行和垂直于偏振激励源的平面。如前所述，任何荧光团配合物的极化值与该配合物的分子旋转速度成反比。因为旋转的速度与分子的大小有关，所以大分子复合物的极化值高，小分子复合物的极化值低。通常，所测荧光是由外源荧光化合物如荧光素或罗丹明产生的。这些化合物与多肽或核酸共价连接，用作示踪剂，以评估结合事件或蛋白质水解引起的质量变化。在没有外源荧光示踪剂的情况下，利用多肽的固有荧光进行本征极化测量。

折叠蛋白的固有荧光是来自个别芳香残基的荧光的混合物，其中色氨酸提供了最显著的部分。色氨酸具有吲哚环结构，其最大吸收波长为280nm，发射峰范围为300 ~ 350nm，取决于局部环境的极性(图1)。色氨酸是一种相对罕见的氨基酸;许多蛋白质只含有一个或几个色氨酸残基。因此，色氨酸荧光极化可以非常灵敏地测量单个色氨酸残基的构象状态。与外源性探针相比，其优点是蛋白质本身不发生变化。使用本征荧光偏振来研究蛋白质构象在实践中仅限于有少数(或可能只有一个)色氨酸残基的情况，因为每个色氨酸残基都经历不同的局部环境，这将产生平均响应。

图1．色氨酸的结构。

材料与方法

蛋白酶(猫# P5147)， NATA(猫# A6501)， RNase T1(猫# R1003)，胰高血糖素(猫# G2044)， melittin(猫# M2272)，人血清白蛋白(猫# A9511)，牛血清白蛋白(猫# A3294)，碱性髓磷脂(猫# M1891)，溶菌酶(猫# L6876)，色氨酸HCl(猫# T8941)和trp - met - asp - pheh - nh2•HCl肽(猫# T6515)采购自Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州)。纯黑色96孔微板(Cat # 3915)来自康宁(Corning, NY)。其他所有化学品都是试剂级的。

比率计实验

用100 μM原液制备了不同摩尔比的人血清白蛋白(HSA)和色氨酸的混合物。将每种混合物的8个重复等分物(100 μL)移至96孔板的黑色孔中，测定荧光偏振。反应在变性(8 M胍或10 M尿素)和自然条件下进行。

蛋白质消化

HSA蛋白(终浓度为100 μM)用不同浓度的蛋白酶在10 mM磷酸盐(pH 7.5)缓冲液存在下37°C消化4小时。测量了荧光偏振。在动力学实验中，通过加入HSA引发反应，每10分钟监测一次荧光极化。

蛋白质变性

HSA蛋白(终浓度为100 μM)与不同浓度的盐酸胍在10 mM磷酸盐(pH 7.5)的存在下，以100 μL /孔缓冲液的总体积在室温下孵育2小时。孵育后测定荧光极化。

蜂毒肽聚合

Melittin蛋白(100 μM终液)与不同浓度的氯化钠在10 mM磷酸盐(pH 7.5)存在的缓冲液中室温孵育30分钟。孵育后测量荧光偏振。

Polirization测量

荧光偏振测量在配置了uv兼容偏振器的Synergy H1多模微板阅读器中进行。对于所有的测量，一个284/10激励和一个340/30发射滤波器与一个320 nm的切向二色镜一起使用。PMT增益设置设置为50，每个数据点有10次读取。

结果

大分子和小分子混合物的荧光极化值由它们的相对比例决定。大分子相对于小分子过多会导致大的极化值，而小分子过多则会导致低的极化值。这是通过将色氨酸氨基酸与人血清白蛋白(HSA)混合来证明的。HSA是一种67kD的蛋白质，只包含一个色氨酸氨基酸。但由于其体积大，使用本征荧光获得的荧光极化值会很高。相反，氨基酸色氨酸非常小，在溶液中极化值很低。图2展示了Synergy H1与uv偏振器的区别色氨酸和HSA的不同摩尔比的能力。以HSA为主的混合物的极化值约为175 mP，而以色氨酸为主的混合物的极化值约为40 mP。此外，这些数据是多次实验的汇编，表明极化测量的可重复性。

图2。人血清白蛋白和色氨酸混合物在非变性条件下的极化值。数据表示多个实验中至少八个独立测定值的平均值和标准差。

利用蛋白质的固有荧光进行偏振测量是基于色氨酸在溶液中旋转的能力。蛋白质中的色氨酸通常位于大多数蛋白质的疏水中心，作为三级结构的一部分，大大降低了其独立于整个肽的旋转能力。如果三级结构完全变性，多肽内的色氨酸基团在聚合物内具有一定的转动自由，而刚性原生多肽则不一定有。这在图3中观察到，其中色氨酸- hsa混合物在其原生和变性状态下测定了荧光极化。

在变性条件下，最大FP值与在原生非变性条件下观察到的相比显著降低(40%)。而含有大量色氨酸的样本则不会受到任何程度的影响。

图3。原生极化与变性极化的比较。在原生或变性(8 M胍或10 M尿素)条件下制备HSA和色氨酸的混合物，并测定荧光极化。数据表示多个实验中至少8个重复的平均值和标准差。

三级结构对荧光极化的影响如图4所示。当只含有单一色氨酸部分的人血清白蛋白(HSA)受到变性化合物胍浓度增加的作用时，荧光极化先增加约10%，然后显著下降。这种增加是由于蛋白质的初步展开增加了它的分子体积;而这种减少是由于蛋白质疏水核心的色氨酸残基在很大程度上被展开释放，从而使吲哚环能够独立于蛋白质旋转。由于色氨酸仍然是蛋白质主干的一部分，当蛋白质完全变性时，其在溶液中的极化值仍然明显大于色氨酸。

图4。随着胍浓度的增加，HSA的极化。人血清白蛋白(HSA)用不同剂量的盐酸胍进行纯化。孵育30分钟后，在紫外激发下测定荧光偏振。数据代表了多个实验中至少八个独立测定值的平均值。

荧光偏振的本质是分辨质量差异的能力。用一般蛋白酶消化人血清白蛋白导致蛋白质被减少成越来越小的肽。因为HSA蛋白中只有一个色氨酸部分，所以只有含有这种氨基酸的肽片段是荧光的。因此，随着蛋白酶对HSA的持续消化，荧光片段有望随着时间的推移而变小。如图5所示，含有100 μg/mL或500 μg/mL蛋白酶的样品随着时间的推移极化值减小，而缺乏蛋白酶的样品极化值恒定。

图5。用蛋白酶消化的HSA随时间的极化变化。用0、100和500 μg/mL蛋白酶在37°C下处理8个重复的样品，并动态测定荧光极化。数据表示8种测定方法的平均值和标准差。

通过使用一系列蛋白酶浓度与固定的消化时间相结合，我们可以绘制出作为酶浓度函数的极化变化。如图6所示，随着蛋白酶浓度的增加，消化4小时后合成的极化值下降。HSA由350个氨基酸组成，其中只有一个色氨酸部分，随着时间的推移会分裂成更小的片段。因为只有含有色氨酸的片段被紫外光激发，所以荧光偏振测量只能反映含有该氨基酸片段的相对长度。

图6。用蛋白酶滴定法测定HSA的荧光极化。用不同浓度的蛋白酶在37℃下处理HSA 4小时。数据点表示多个独立实验中至少8个重复的平均值和标准差。

如图5所示，随着时间的增加，片段长度减少，如图6所示，随着酶的增加，可以达到同样的效果。因为消化没有进行到单个氨基酸的点，在最大酶浓度下的极化值比用色氨酸观察到的要大。

紫外荧光偏振可以用来识别不同分子质量的多肽。如图7所示，利用荧光偏振可以分辨出原生蛋白质的质量差异。当分子量小于1000的短肽表现为线性方式时，较大肽的极化随质量的增加而增加，这表明二级和三级结构肯定对色氨酸在溶液中的自由旋转能力起作用。许多这类蛋白质(如HSA, melittin，碱性髓磷脂，胰高血糖素，RNaseT1和Trp-Met-Asp-Phe肽)在每个多肽链上只含有一个色氨酸，这些蛋白质的极化值反映了这一单一氨基酸的旋转。牛血清白蛋白和溶菌酶分别含有2和4种色氨酸;因此，返回的FP值将反映一个平均值。

图7。极化和肽质量的比较。在原生非还原条件下，测定了不同分子量肽(蛋白酶、NATA、RNase T1、胰高血糖素、蜂毒素、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、碱性髓磷脂蛋白、溶菌酶、trp - met - p - phe - NH2•HCl肽和色氨酸)在pH 7.5下的荧光极化。数据表示8个测定值的平均值。

Melittin是蜜蜂毒液中含有26个氨基酸的肽，被用作研究蛋白质折叠[2]的模型。Melittin由单体随机线圈转化为α-螺旋四聚体，离子强度增大[2]。随着二聚体和四聚体的形成，转动质量大幅度增加。如图8所示，这种质量的变化可以通过荧光偏振监测到。

图8。Melittin多定时器形成。在pH为6.5的条件下，在氯化钠浓度增加的条件下孵育Melittin蛋白30分钟，测定荧光极化。数据表示8次测定的平均值。

讨论

虽然微板中固有蛋白荧光的测量已被广泛使用，但从相同信号中测定荧光偏振还没有得到明显的应用。这些数据表明，适当配置的Synergy多模微板读取器可以用于从本征蛋白荧光进行荧光偏振测定。

荧光极化本质上是一种测量大小变化的测定方法。小的有标记的配体附着在更大的物体上的结合事件，其结果是旋转质量更大。这些反应的荧光极化测量结果实际上是标记配体(小)和标记结合配体(大)分子的混合物的平均值，而未标记的大分子是不可见的。色氨酸和只有一种色氨酸的HSA分别相当于一个标记的配体和一个与受体结合的配体。根据两分子的摩尔比，两分子的混合物应呈现不同的极化值。

多肽的消化会产生比原来分子更小的碎片。因为本质荧光主要是由色氨酸发射产生的，这些肽的偏振测量有效地模拟了含有色氨酸的肽的大小，而其他片段是不可见的。含有多个色氨酸的蛋白质会产生许多荧光片段，其合成的偏振值是所有片段的平均偏振值。

变性研究表明HSA中的色氨酸部分位于三级结构[3]区域。在完全变性条件下的荧光偏振明显小于在原生条件下观察到的荧光偏振(图3)。在使用不同数量的变性试剂的实验中，FP值在低量变性剂的作用下略微增加，然后下降(图4)。HSA在紫外激发下的荧光偏振本质上是对单个色氨酸自由旋转能力的测量。天然蛋白质当然有一个三级结构，允许蛋白质作为一个单位旋转。随着胍变性浓度的降低，蛋白质开始分解，有效地增加旋转尺寸，同时仍然保持色氨酸氨基酸锁定在其局部三级结构中，导致较高的极化值。随着进一步变性，蛋白质被完全放松，允许色氨酸氨基酸在蛋白质的多肽酰胺键内自由旋转，这被测量为极化值的降低。

在微板中使用可见光激发波长进行荧光偏振测量已成为一项常规工作。这些实验采用了一种共价连接的荧光示踪剂，并与感兴趣的配体相连接。这些测定的假设是示踪剂不干扰测量。具有少量色氨酸基团的单个多肽和蛋白质的偏振测量是有利的，因为不需要对蛋白质进行修饰。多肽的固有物理性质被用作荧光源。需要注意的是，读取器硬件能够在光谱的UV部分进行测量。这些数据是Synergy H1多模微板阅读器在配置uv偏振过滤器时能力的一个例子。

参考文献

1. Held, P.(2003)在Synergy HT多模微板阅读器中使用紫外荧光定量肽和氨基酸，BioTek仪器应用笔记，//www.aspinnursery.com/resources/articles/ Peptide - Amino -acids-fluorescence.html2022卡塔尔世界杯完整赛程
2. Wilcox, W.和D. Eisenberg(1992)由圆二色法确定的Melittin四聚化热力学及其对蛋白质折叠的影响，蛋白质科学，1:641-653。
3. Kumar, S.和R. Swaminathan(2007)利用色氨酸的荧光各向异性和猝灭动力学寻找变性蛋白质中的残留结构，化学杂志。Sci 119:141 - 145。

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