2015年7月1日
作者: Brad Larson和Peter Banks, BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT，美国;威廉Glomm,Sintef，挪威特隆赫姆
简介
在油、气和水分离过程中的主要废物之一是生产废水，这乐鱼平台入口通常是一种含有油、盐、化学品、固体和微量金属的地层和注入工艺水的混合物。监测石油生产和精炼废水中的含油量，对于满足将采出水返回环境的严格规定至关重要，这是由美国环境保护署(EPA)监管的。由于目前的趋势是进一步减少采出水中原油的释放量，因此需要更先进的方法来精确检测提纯样品中的微量石油;很多时候达到百万分之一(ppm)或十亿分之一(ppb)的水平。
历史上，油气行业曾使用许多参考方法来测量采出水中的含油量。这些方法包括红外吸收、重量法、气相色谱法和火焰电离检测(GC-FID)方法。然而，没有一种被普遍采用，而且都有局限性。虽然红外方法很容易使用，并且可以在现场部署，但它们涉及使用已被证明致癌或对环境有害的溶剂。重量法价格便宜，也易于使用，但不能提供关于样品组成的细节，而且受蒸发限制。GC-FID没有以前的方法所存在的问题。然而，由于需要复杂的仪器和对潜在操作人员的高度培训，它也没有被广泛接受。
新的方法，包括荧光探针，可以减轻以前列出的每一种方法的局限性，也提供了高水平的灵敏度。这种探针也可以用来监测其他污染物，只要染料分子在污染物中有很高的分配系数。将探针引入原油中，在净化过程中被稀释。完成后，样品可以很容易地使用microplate reader技术进行监测，而不需要有害的溶剂或复杂的程序。在评估可能引入监测过程的新探针时，重要的是首先了解荧光分子的激发和发射光谱，然后能够调整光学系统，以提供适合在严重稀释时检测荧光探针的最高灵敏度。
在这里，我们演示了使用基于单色仪的微板阅读器检测系统记录用于生产出水的荧光探针的激发和发射光谱的能力。光谱提供了启动激发和发射单色仪波长和带宽选择优化过程的能力。在这里，我们演示了两个具有窄(23 nm)或宽(67 nm)斯托克斯位移的单个探针的优化。基于单色仪的系统的灵活性还允许使用多个荧光探针，因此可以对最终水流中的多个潜在污染物进行评估。
材料与方法
材料
荧光污染物探针
未知纯化荧光污染物探针201和204由Sintef(挪威特隆赫姆)捐赠。每个探针的原液浓度为1mg /mL，或1000ppm, 100%甲醇。
Synergy™Neo2 Multi-Mode Microplate Reader是专为速度和超高性能设计的，结合了BioTek的专利混合技术™。独立的光路可以满足不同的检测要求，具有可变带宽的四重单色仪，敏感的基于滤波器的光学，基于激光的Alpha检测激励和高达4个pmt的超快速测量。先进的环境控制，包括CO2/ O2控制，培养到65°C和可变振动是理想的活细胞测定和细胞基础检测与直接底部照明优化。条形码标记的过滤器立方体有助于简化工作流程和限制错误。
方法
荧光探针滴定法的建立
由70%甲醇/30% 0.2 M氢氧化钠组成的溶液用于稀释每个探针。原液最初由原来的1000ppm浓度稀释到1000ppb。然后使用1:2稀释方案进行一系列滴定，创建一个11点滴定系列，范围从1000-1 ppb，除了一个只有稀释剂的空白对照。
基于光谱扫描和荧光单色的微板读数
使用含有1000ppb样品的单孔对未知荧光探针进行激发和发射扫描，以确定光谱特征。然后使用可变带宽单色仪多次读取整个滴定范围，同时改变激发和发射设置和带宽。对所提供的每个样品都执行了该过程。
信噪比与检测极限的确定
信噪比(S:N)计算公式如下:
(RFU探针-平均RFU空白) / Std Dev空白
在RFU探针来自含有探针滴定的井的荧光信号是平均RFU空白等于仅含稀释剂的井的平均信号，而Std Dev空白等于同一空白井RFU值的标准差。检测极限(LOD)的计算方法为最低探针浓度，其S:N比为3，或空白RFU值为空白标准偏差的三倍。
结果与讨论
荧光探针光谱分布图
该过程的第一步是准确确定未知样品201的激发光谱和发射光谱。在Gen5软件中创建光谱扫描读取步骤，并使用1 nm增量进行，以完全捕获两种光谱的形状和强度。
图1所示。样品201激发和发射光谱。
在每个测试波长处捕获原始RFU值。然后，通过找到产生最高RFU值的波长进行归一化处理，并将其他RFU值除以最大值。然后绘制每个包含波长值的百分比最大RFU(%最大RFU)值，以创建如图1所示的两个图。测定探针的斯托克斯位移为23纳米。
样品201单色仪设置优化:峰值评估
为了检测纯化水样中原油或其他污染物的最低水平，要求荧光探针的检测极限为单ppb水平或更低。因此，我们对单色仪进行了优化，以确定最理想的激发和发射设置，以及满足既定标准的带宽值。
第一步是在读取步骤中在先前确定的探针光谱峰值处设置激发和发射值(在峰值上)。从最小波长范围3 nm到最大波长范围50 nm，评估了多个带宽值(图2)。
图2。样本201关于峰值可变带宽波长覆盖。包括激发和发射带宽设置为3、6、9、12、15或20 nm时显示的波长。30nm、40nm和50nm带宽的图未显示-波长过度重叠导致串扰，激发光被发射单色仪捕获。
包含探针浓度的井，如前面描述的那样稀释，然后在96孔黑板中读取，每个数据点使用10次测量，板移动后延迟100毫秒。
图3。峰值样本201计算信噪比值。激发和发射分别设置为确定的峰值494和517 nm。S:对于30nm、40nm和50nm带宽设置，N值无法计算。
从含有井RFUs的探针中减去只有稀释样品的平均值，以创建一个空白值。然后将这个数字除以从稀释井计算出的标准偏差值，得到所测试的每种探针浓度的S:N比。平均S:N值然后用log:log刻度与已知的[ppb]绘制(图3)。
从图3的结果可以看出，随着带宽扩展，包括更大的波长范围，达到12 nm，所有测试浓度的S:N比都会增加。这是由于用于激发荧光分子的光的数量增加，以及发射过程中捕获的荧光范围增加。此外，游戏中还存在最小的相声，这将导致游戏的背景关卡最小化。然而，当使用大于12 nm的带宽值时，捕获的串扰量增加，导致背景荧光增加并降低S:N比。最终，在使用30 nm及以上带宽值的情况下，背景信号太大，以至于无法再对荧光信号进行精确量化。
当检查测试带宽的LOD值(表1)时，图3的结果得到了确认。当选择9或12 nm带宽时，LOD最低。同样明显的是，增加的背景荧光在带宽为20 nm时开始显著影响读取的灵敏度。
表1。关于检测值峰值限值的样本201。激发和发射值分别设置在494 nm和517 nm。
因此，如果希望在确定的光谱峰值处设置读取的激励和发射值，则可以将12 nm的带宽纳入其中，以产生最高的S:N比，最低的LOD和足够的灵敏度用于采出水出水分析。
样品201单色仪设置优化:非峰值评估
虽然在光谱峰值处设置激励和发射值可能是最终用户的愿望，但它可能并不总是产生最高的S:N比和最敏感的读参数。当荧光分子具有较窄的斯托克斯位移时，这尤其正确，这导致激发光谱和发射光谱之间有较大的重叠，如样品201所示。因此，测试设置要尽量减少不必要的串扰，但也要允许最优的波长范围，这将为荧光探针创建最敏感的读取可能。
在样品201的情况下，根据23 nm的Stokes位移，对参数进行了测试，使最高包含的激发波长和最低包含的发射波长分别固定在峰值确定值494和517 nm。然后将设定的激励和发射值适当地移到峰值的左右，以允许合并更宽的带宽范围，而不会出现串扰问题(图4)。
图4。样本201非峰值可变带宽波长覆盖。激发波长和发射波长之间保持恒定的23纳米间隙。当激发和发射带宽设置为3、6、9、12、15、20、30、40和50 nm带宽时显示的波长覆盖。
S:N比率再次计算，如前所述。在检查图5中的结果时，很明显，在执行上峰值优化时可以看到相同的模式。允许增加数量的光激发样品，同时捕获更大范围的发射信号增加S:N比。使用20nm带宽时达到最大值，其中使用较大的带宽开始受到背景增加的影响，降低S:N比。然而，同样清楚的是，与在光谱峰值上使用激励和发射设置相比，通过最小化不必要的串扰捕获，背景电平进一步降低。S:N比率可以达到比以前测试所能达到的高十倍之多。
图5。非峰值样品201计算信噪比值。适当设置激发和发射值，以保持包含的波长之间的23 nm的间隙，并合并3-50 nm的带宽。
较高的S:N比也会使ppt水平的LOD值比使用峰值单色仪设置时的LOD值低10倍(表2)。
表2。样品201检测值的非峰值外推极限。
使用样品201执行的整套读取结果证实，使用适当优化的单色仪设置，即使使用带有狭窄斯托克斯位移的荧光探针，LOD要求也可以满足并轻松超过约1000倍。
样品204荧光探针光谱剖面
第二个样品也进行了评估，以确定最佳单色仪设置。再次使用1 nm增量进行光谱扫描，以捕获两种光谱的形状和强度。
图6。样品204激发和发射光谱。
在绘制光谱扫描归一化信号时，可以看到样品201的光谱曲线包含陡峭的肩和狭窄的Stokes位移，样品204的曲线包含更宽的肩和67 nm的宽Stokes位移。
样品204单色仪设置优化:峰值评估
在一个读步的激发和发射值分别设置在先前确定的探针光谱峰值(616 nm和683 nm)上。再次从3 nm到50 nm的最小波长范围内评估多个带宽值(图7)。
图7。样本204关于峰值可变带宽波长覆盖。包括分别选择616和683 nm激发和发射值，带宽设置为3、6、9、12、15、20、30、40或50 nm时显示的波长。
样品204以与前一个样品相同的方式稀释，并在相同的96孔黑板类型中读取，每个数据点使用10次测量，板移动后延迟100毫秒。
图8。峰值样本204计算信噪比值。激发和发射设置为确定的峰值分别为616和683 nm。
根据与已知[ppb]相关的平均S:N值的计算和绘图(图8)，很明显，扩大带宽会增加S:N比，直到在加入30、40或50 nm范围时达到一个平台。这可以归因于荧光探针的宽斯托克斯位移。这允许激发和发射曲线中产生最高百分比荧光的区域被包含在读取步骤中，而不用担心由于捕获了高水平的不必要的串扰而增加的背景信号，如样品201所示。
表3中的外推LOD值证实了这一点，因为显示出30-50 nm带宽的最大灵敏度的读数。
表3。关于检测值峰值限值的204样本。激发和发射值分别设置在616 nm和683 nm。
由于宽斯托克斯位移和低水平的串扰，也没有必要移动激发和发射设置离开荧光探针的确定峰值。上述结果再次表明，单色仪设置可以优化，这一次使用具有宽斯托克斯位移的荧光探针，超过既定的LOD要求。
结论
采用荧光探针检测污水流中的痕量原油和其他潜在污染物，可以大大简化分析程序，并提供以前方法无法达到的灵敏度水平。随着基于单色仪的微板阅读器的加入，其中包含可变带宽单色仪，该过程可以得到更大程度的增强。基于单色仪的检测允许同时确定多种污染物的水平，而不需要更改读取器设置。可变带宽功能可以进行多个级别的优化，以找到每个荧光探针的理想设置，以确保实现最健壮、最敏感的读取参数。
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