使用相位对比成像跟踪细胞形态学变化由于凋亡活性

作者:布拉德·拉森和彼得·班克斯， 安捷伦科技公司

简介

表型筛选，或确定一个分子对细胞、组织或整个生物体的影响(表型)，可以追溯到最早的药物发现工作。由于20世纪90年代分子生物学和生物化学的进步，这种方法不再被重视，取而代之的是一种更简化的基于目标的方法。¹然而，从越来越多的证据来看，这种转变似乎不仅未能加速新一流药物的发现，而且还导致了新铅分子的更高损耗率。²因此，现在正在实施一种更平衡、更全面的方法，它结合了两种发现方法。

细胞凋亡是最重要和被广泛研究的表型反应之一;特别是在肿瘤学研究方面。了解细胞凋亡与特定疾病的关系有助于理解其发病机制，以及如何治疗。在癌症中，细胞通过特定刺激走向死亡的正常过程失去了，导致细胞分裂失控。这是疾病发展和进展的一个主要原因。^3.有多种方法可以跟踪整个细胞或特定细胞器的凋亡活性，包括抗体、荧光染色剂和预发光底物。这些方法虽然易于使用，但除了裂解或固定和渗透外，还会通过外来物质的引入导致细胞原始状态的改变，并可能降低进行多路复用分析的能力。通过细胞成像，形态学变化是凋亡的标志，包括细胞收缩和分裂成膜结合的凋亡小体⁴，可以以无标签的方式进行监控。

本应用笔记演示了一种方法，结合自动化，数字广域相位对比显微镜来监测铅分子的潜在凋亡效应。能够在37°C/5% CO控制成像室的条件₂在整个潜伏期内每小时捕捉一次动力学图像。2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTekGen5细胞分析软件还允许计算圆形凋亡细胞。用荧光活细胞法测定细胞凋亡活性。结果证实了基于图像的方法在提供准确的凋亡诱导分析方面的有效性。

材料与方法

材料

细胞: MDA-MB-231电池(零件号92020424)从Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州)购买。MDA-MB-231细胞在高级DMEM培养基(部分编号12491-015)+胎牛血清(FBS)， 10%(部分编号10437-028)和笔- strepglutamine, 1x(部分编号10378-016)中繁殖，分别来自Life Technologies (Carlsbad, CA)。

试剂:动能凋亡试剂盒(零件号ab129817)购自Abcam (Cambridge, MA)。Oridonin(零件号O9639)和Hoechst 33342(零件号14533)从Sigma-Aldrich购买。

2022世界杯南美区预选赛 cyation 5结合了自动数字显微镜和传统的多模式微板检测，提供了丰富的表型细胞信息和基于良好的定量数据。Cytation 5特别强调活细胞测定，温度控制到65°C, CO₂/ O₂气体控制，以及用于动力学分析的双注射器。使用相位对比和GFP成像通道分别监测形态学变化，以及来自动力学凋亡试剂的荧光变化。

2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen5数据分析软件: Gen5软件控制Cytation 5的操作，用于自动数字显微镜和基于ppm的微板读取。图像分析和亚种群计算允许计数凋亡细胞达到预定的信号阈值和圆度要求。

方法

细胞制备和分配到微板:收集细胞，稀释至浓度5.0 × 10⁴细胞/毫升。然后将100 μ L的体积分配到来自康宁生命科学公司(Corning, NY)的96孔透明底，黑色tc处理微板(零件号3904)的适当孔中。

组分制备和添加:将Hoechst 33342稀释至最终1倍浓度5µM的培养基中。去除镀液后，每孔加入100µL的稀释染料，在37°C/5% CO中孵育15分钟₂．将pSIVA-IANBD凋亡试剂以10µL/mL的浓度稀释于培养液中，然后将冬冬素稀释至含凋亡试剂的培养液或单独的培养液中至100µM。连续进行2.5倍稀释，创建两条12点滴定曲线(包括无化合物对照)，浓度范围为100 ~ 0.01 μ M。孵育15分钟后，再次取出培养液，更换100µL的含或不含凋亡试剂的化合物。

基于动态图像的凋亡诱导监测:包含细胞和化合物的96孔板立即被放置到Cytation 5中，温度和气体控制预先设置为37°C/5% CO₂．使用4x和20x物镜完成了每口井的成像。相位对比成像通道用于从含有非标记细胞的孔中捕获图像，而来自pSIVA-IANBD试剂的荧光信号则使用GFP通道成像。选择了不连续动力学程序，在24小时潜伏期内每小时对每个指定井进行一次成像。

2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen5细胞分析:使用Gen5软件对捕获的4倍相位对比和GFP图像进行细胞分析。每张图像的凋亡细胞数量通过对比的变化和这种细胞类型所显示的圆形的增加进行形态学计数，并通过外部磷脂酰丝氨酸暴露的荧光跟踪来确认。表1和表2描述了使用相位对比和GFP通道计数细胞的参数。

表1。4倍相位对比图像元胞分析参数。

表2。4 × GFP图像细胞分析参数。

结果与讨论

用相位对比成像分析细胞凋亡诱导

从用20x物镜捕获的相位对比图像的视觉分析(图1)，可以识别出凋亡细胞的许多特征形态学特征。细胞收缩和细胞质凝结导致细胞变圆，是早期凋亡的标志⁴，见图1B。分离成凋亡小体或泡，是细胞凋亡晚期的标志⁴，亦见图1C及1D。

图1．基于相位对比图像的细胞凋亡诱导监测。用(a) 0， (B) 1， (C) 40，或(D) 100 μ oridonin孵育7小时后的MDA-MB-231细胞的20倍相位对比图。

凋亡活性的无标记量化也可以使用4x物镜对孔内的大部分总细胞群取样(图2A)，并使用Gen5数据分析软件进行。使用表1中描述的主要细胞分析参数，在图像中的细胞周围绘制对象掩码(图2B)。然而，并不是图像中的所有细胞都是凋亡的。因此，还应用了一种利用凋亡细胞圆形外观的亚种群标准(图2C)。健康细胞以非圆形的方式分布在井底。这一次要标准可以更准确地计数正在发生凋亡的细胞。

然后，通过比较从处理过的孔和未处理的孔中鉴定出的细胞数量，可以确定测试分子在不同端点的凋亡效应(图3)。

图2。凋亡细胞的测定。(A) MDA-MB-231细胞在40 μ M oridonin孵育后的4倍相衬图像。(B)使用初始细胞分析参数的总对象计数。(C)应用亚群体参数后的凋亡细胞计数。

图3。细胞凋亡诱导的量化。在7、12和24小时孵育期后，含有10至100,000 nM冬凌素的孔与未处理孔的细胞计数比率。

动力学凋亡分析

由于使用了无标签分析方法，不需要添加终点试剂，因此也可以通过在成像室中加入温度和气体控制来进行凋亡诱导的动力学分析(图4A至4C)。这样就可以对所检查的所有浓度进行更明确的调查。

图4。细胞凋亡诱导的动力学监测。在(A) 0-， (B) 7-， (C)与40µM oridonin孵育24小时后捕获的MDA-MB-231细胞的20x相位对比图像。(D)细胞计数的动力学4x图像的孔含有细胞处理的0,40和100 μ M oridonin。(E)处理井与未处理井的细胞数量比。

细胞计数和随后的细胞比率图(图4D至4E)表明，随着冬凌素浓度的增加，细胞凋亡的诱导速度加快。然而，诱导水平没有达到较低浓度所见的水平。这很可能是由于细胞内的明显毒性水平较高，导致坏死，而不是凋亡。

荧光活细胞试验验证

通过对经过Hoechst 33342和动力学凋亡试剂预培养的毛蕨素处理和未处理的孔进行细胞分析，完成了相位对比成像生成的数据的验证(图5)。表2概述了荧光分析所用的参数。

外界暴露的磷脂酰丝氨酸(PS)被认为是早期凋亡的标志。然而，越来越多的知识支持这样一种观点，即短暂暴露发生在细胞死亡过程中进一步发展的过程中。^5、6这种现象在绿齿蕨素处理过程中也可以看到(图5)。绿色pSIVA试剂最初几乎看不到信号。在与较高浓度的分子孵育7小时后，试剂与PS结合后显示出高水平的荧光(图5B)。在长时间暴露后，信号减弱(图5C)，表明细胞凋亡的后期阶段。

使用相位对比或荧光成像计算的处理井与未处理井的比值对比表明，与荧光活细胞试剂的信号波动相反，在跟踪细胞形态变化时可以看到相同的结果(图6)。

图5。荧光凋亡活性监测。用Hoechst 33342(蓝色)和动态凋亡试剂(绿色)染色的MDA-MB-231细胞的4x动态图像。(A) 0-， (B) 7-， (C)用40µoridonin孵育24小时后捕获的图像。

图6。细胞分析方法比较。在(a) 7-， (B) 12-，或(C) 24小时的冬凌素孵育后，使用4倍相位对比或荧光图像计算细胞计数比率。

结论

使用形态学变化是一种理想的方法来跟踪靶细胞类型的凋亡活性，因为该过程是无标签的和多路复用的可能性。在这一过程中发生的形态学变化被很好地描述，并出现在所有细胞类型中，保持分析一致。引入光学探头或其他衬底时可能看到的任何潜在偏差也被消除。通过结合相位对比成像，该技术可以与Agilent BioTek Cytation 5细胞成像多模式阅读器完成。2022世界杯附加赛决赛使用20x物镜拍摄的高倍率图像提供定性评估，而使用低倍率图像(如4倍)，加上安捷伦BioTek Gen5微板阅读器和成像软件，可以进行定量和统计判断。2022世界杯附加赛决赛成像室内的温度和气体控制也可以实现自动动力学评估。这种结合提供了一种简单而有力的方法来研究这种细胞死亡的重要机制。

参考文献

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