thapsigargin诱导的细胞应激反应和gq依赖性钙信号的抑制

作者:乔·克莱顿和彼得·班克斯，安捷伦科技公司;凯文·哈伦和汤姆·休斯，蒙大拿分子



电影1:1 nM thapsigargin_诱导细胞应激
电影2:1 μ M thapsigargin_诱导细胞应激
电影3:1 nM信号6小时Gq信号
电影4:1 μ M thapsigargin 6小时Gq信号

摘要

在本应用中，我们使用了一种新型内质网应激传感器，以及一种基于自动成像的方法，通过thapsigargin(一种有效的SERCA泵抑制剂)评估化学诱导的细胞应激，同时测量其对gq介导的细胞信号传导的影响。这些结果表明，thapsigargin诱导的细胞应激在细胞增殖发生任何变化之前被检测到一个数量级。细胞应力水平的动力学监测显示了应力传感器的可逆性。应激水平在治疗6至7小时后达到峰值，但细胞在22小时后从应激中自然恢复。Gq - Ca的依赖^{2 +}信号转导素在治疗6和24小时均以剂量依赖性的方式减少，表明内质网应激对Gq介导的Ca^{2 +}即使在细胞关闭内质网应激反应机制后，信号仍然存在。

简介

内质网(内质网)介导的细胞应激和未折叠蛋白反应(UPR)是真核细胞应激的主要途径。内质网应激和UPR可由包括内质网钙失调在内的一系列细胞扰动触发^{2 +}内质网腔内错误折叠蛋白质的积累和活性氧。^{1 - 3}内质网应激与许多疾病有关，包括神经退行性疾病、癌症、糖尿病和局部缺血，^{2, 4 - 6}这也是药物开发和毒性测试的一个新兴兴趣领域。^{7 - 10}激活的蛋白酶通路，如UPR和内质网应激作为细胞应激或毒性的早期指标，这是一个有用的机制来检测药物或化合物诱导的细胞应激。^11、12

UPR由三个臂组成，每个臂激活一个独特的机制来调节细胞对内质网应激的反应。¹检测内质网应激激活和UPR的方法包括基于pcr的分析和荧光指标。^13、14然而，目前很少有内质网应力探测器是不可逆的指标，优化以检测化学和基因诱导的应力。本应用说明演示了使用由Montana Molecular开发的市售内质局应激传感器来检测thapsigargin(一种有效的SERCA泵抑制剂)化学诱导的细胞应激，并同时检测其对Gq介导的细胞信号传导的影响(图1)。使用Agilent BioTek Lionheart FX自动显微镜对内质网应激进行高含2022世界杯附加赛决赛量分析，可以检测thapsigargin诱导的细胞应激的发生和恢复，同时检测24小时内gq介导的细胞信号。将细胞应激和信号的活细胞检测与动态高含量监测相结合，可以精确检测细胞应激水平的变化及其对细胞信号事件的影响。

图1所示。基因编码荧光生物传感器检测内质网应激。内质网应激激活了位于内质网膜上的IRE1蛋白的一种独特的剪接活性。IRE1执行了一个非常规的剪接事件，移除XBP1 mRNA中的一个内含子，以产生一个功能转录因子来上调应激反应基因。该系统被用来创建一个基因编码荧光生物传感器来检测内质网应激。该传感器表达组成表达的核定位红色荧光蛋白来标记转导的细胞。在细胞应激激活后，编码到生物传感器的XBP1内含子被移除，细胞核定位的亮绿色荧光蛋白mNeon green也被表达出来。定量一个群体中含有绿色荧光和组成性表达的红色荧光的细胞数量作为内质网应激水平的量化。在本研究中，SERCA泵抑制剂thapsigargin被用于通过破坏Ca应激细胞^{2 +}急诊室内部的动态。

材料与方法

2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Lionheart FX自动显微镜

Lionheart FX是一款全包系统，优化了活细胞成像，可实现高达100倍的空气和油浸放大(图2)。亮场、彩色亮场、相位对比和荧光通道为广泛的成像应用提供最大支持。一个独特的环境控制盖提供孵化到40°C和有效遏制CO₂/ O₂控制。湿度室和试剂注入器为活细胞成像工作流程增加了更大程度的环境优化。2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen5 3.0微板阅读器和成像软件提供自动图像捕获、处理和分析，以及注释和电影制作功能。Gen5 3.0提供了广泛的活单元和固定单元应用程序的简易性。

图2。2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Lionheart FX自动显微镜具有双试剂注入模块。

电池应力传感器

细胞应激传感器是一种基因编码荧光生物传感器，当细胞承受内质网(ER)应激或经历折叠蛋白反应(UPR)时，产生非常明亮的荧光。该生物传感器是一种双色生物传感器，允许对细胞应激和毒性进行比率检测。计算构成表达的核局域化红色荧光蛋白与应激诱导的核局域化绿色荧光蛋白之间的荧光比，以确定细胞应激水平。或者，将一个群体中同时表达绿色和红色荧光的细胞与那些只表达红色荧光的细胞进行比较，可以用来确定该群体中应激细胞的百分比。大量的化合物和基因突变都能诱发内质网应激。UPR是细胞内的主要应激通路之一，它允许应激传感器检测到广泛的应激诱导刺激，其中一些主要目标不是内质网。

R-GECO

红色荧光，基因编码Ca^{2 +}指示因子(R-GECO)的荧光强度随着细胞内钙水平的增加而增加R-GECO的最佳激发波长为590 nm，发射波长为600 ~ 700 nm。R-GECO可以与其他来自Montana Molecular的GPCR生物传感器配对，包括cADDis，一种绿色荧光cAMP传感器，或绿色荧光向上和向下的二甘油酯(DAG)传感器，以同时检测Ca和Ca^{2 +}cAMP或Ca^{2 +}以及活细胞中的DAG。BacMam传递系统能够在多种细胞类型(包括ipsc来源的心肌细胞)中实现一致和可控的表达。

细胞转导和电镀

HEK293细胞在含10%胎牛血清和5% CO青霉素-链霉素的高级DMEM培养基中培养₂37°C。培养物在80%汇合时常规胰酶(0.05%胰蛋白酶- EDTA)。细胞转导遵循蒙大拿州分子协议，体积优化为细胞密度和病毒滴度，以及所需的样本数量。简单地说，将病毒转导反应(25µL R-GECO传感器BacMam, 10µL细胞应力传感器BacMam, 5µL 300 mM丙戊酸，1µL hM1受体，9µL FluoroBrite DMEM (Thermo Fisher) + 10% FBS和pen/strep)添加到150000细胞/mL FluoroBrite DMEM细胞悬液100µL中。轻轻混合后，将150 μ L的混合物每孔播种于Costar 3904 96孔微板中，然后用铝箔覆盖以保护其避光，并在组织培养罩中培养30分钟。然后将细胞转移到37°C培养箱中，在正常生长条件下培养24小时，以确保最佳的传感器表达。

成像过程

转染细胞24小时后，用新鲜的含thapsigargin的FluoroBrite DMEM(3.0 ~ 0.001µM)替换生长培养基。在加入thapsigargin后，立即将平板转移到Agilent BioTek Lionheart FX自动显微镜中，配有配有FluoroBrite D2022世界杯附加赛决赛MEM和180µM (6x final)卡巴胆的试剂注入器。

受体激活实验在室温下，10倍物镜下进行。R-GECO传感器使用RFP 531 Ex, 593 Em LED滤波器立方体成像。细胞应力传感器使用GFP 469 Ex, 525 Em LED滤波器立方体组成像。RFP通道暴露设置经过优化，以显示具有基线R-GECO荧光水平的细胞，而在添加激动剂后，RFP通道暴露设置足够低，以适应R-GECO荧光水平的显著增加。GFP通道曝光设置固定，使细胞群中的基线细胞应力传感器荧光暗淡但可见。使用激光自动对焦立方来保持对焦。每个通道的捕获速率为0.5帧/秒(FPS)。20µL FluoroBrite DMEM + 180µM (6x final) carbachol，时间为13秒，共85秒获取图像。

动力学细胞应力实验的图像是使用如上所述的RFP和GFP通道，以及通过与10x相位物镜的相位对比获得的。在24小时的时间里，图像每小时采集一次。环境生长条件(5% CO₂， 37°C和~80%的湿度)在整个实验过程中保持在Lionheart FX内。

结果与讨论

细胞应激和毒性的比率测定

使用细胞应力传感器监测thapsigargin诱导的细胞应力。计算绿色(细胞应力传感器)与红色(核标记)荧光强度的比值，以解释在不同条件下细胞数量的变化。绿色与红色荧光比的动力学曲线显示，细胞应激峰值在该蛋白处理约6小时后达到，在最高浓度的该蛋白下观察到的绿色与红色荧光比增加了两倍以上(图3)。

图3。绿色与红色荧光强度之比的动力学剖面。绿色(细胞应激传感器)与红色(核标记物)荧光强度的比值表明，在治疗后约6小时，thapsigargin诱导的HEK293细胞应激达到峰值，然后恢复到接近基线。

虽然细胞应激的比率检测为评估细胞群中诱导应激水平提供了有价值的终点指标，但随着时间的推移，核标记表达水平的变化可能导致难以解释的动力学曲线。结果表明，压力水平似乎下降到基线以下，这是由于在24小时内核标记的表达水平稳步增加。

利用表达红核标记和自动图像分析进行动态细胞计数

Gen5微生物板阅读器和成像仪软件用于确定每孔中存在的细胞数量，以便在评估细胞应激水平时更准确地解释整个实验中种群大小的变化。Gen5自动化软件通过在每个时间点的每个标记核周围放置物体屏蔽来获得细胞计数(图4)。得到的动力学曲线表明，细胞数量在3.0和1.0 M thapsigargin处理后的6小时内开始减少，而所有其他处理条件在24小时内导致了细胞的健壮增殖(图5)。

图4。使用安捷伦BioTek Gen5图像分析软件和细胞应力传感器红色核标签自动测定细胞数量。2022世界杯附加赛决赛(A)细胞相位对比图。(B)红色核标签对应的RFP图像。(C)使用RFP通道将物体掩模放置在每个细胞核周围，生成精确的动力学细胞计数，用于评估细胞增殖和活力。

图5。高浓度的thapsigargin抑制细胞增殖。基于红色核标记的HEK293细胞计数动力学评价表明，thapsigargin的3 μ M和1 μ M浓度显著抑制细胞计数。在所有其他thapsigargin处理下生长的HEK293显示出强健的细胞生长。

显示应激反应的细胞百分比

使用如上所述的红色核标记来确定每孔的细胞总数。然后测量每个细胞内细胞应力传感器的荧光强度，并用于确定受应力的细胞数量(图6)。计算受应力细胞与细胞总数的比率，并以受应力细胞百分比报告。受应激细胞百分比的动力学曲线(图7)，结合动力学增殖曲线，提供了一个更详细和准确的评估细胞应激反应的thapsigargin治疗。对thapsigargin治疗对细胞应激反应随时间变化的剂量依赖性效应进行了定量分析，使用每个百分比应激剖面的曲线下面积(AUC)，计算出EC₅₀值370 nM(图8)。

图6。使用Agilent BioTek Gen5对象掩蔽技术量化每个细胞内的细胞应力传感器荧光，提供了更详细的应力响应评估。2022世界杯附加赛决赛(A)在整个实验过程中捕获的相位对比图像可以对细胞形态随时间的变化进行定性评价。(B) RFP通道捕获的图像用于使用红色荧光标记的细胞核和Gen5对象掩膜识别和计数每个细胞。(C)然后使用GFP通道测量每个细胞内细胞应力传感器对应的荧光强度。(D)使用Gen5亚群体分析定义应激细胞(紫红色掩膜)和非应激细胞(黄色掩膜)。

图7．受力细胞百分比由Agilent BioTek Gen5自动计算，为评估受力反应提供了一个敏感的和生物学相关的指标。2022世界杯附加赛决赛

图8。thapsigargin对细胞应激水平的剂量依赖性效应的定量研究。用百分比受应力细胞剖面的AUC来计算EC₅₀值从动力学数据。

thapsigargin治疗24小时内对gq依赖性钙信号的影响

表达gq偶联hM1受体和R-GECO钙传感器的HEK293细胞被thapsigargin(一种有效的SERCA泵抑制剂)处理，以评估thapsigargin对gq依赖性钙信号的长期影响。卡巴hol (30 μ M final)通过对齐的试剂注入器添加到细胞中，在三个不同的时间点刺激hM1受体:治疗后0、6和24小时。每个时间点都使用独立的井(即每口井在0、6或24小时内单次注入甲醇)。每个时间点R-GECO荧光的动力学曲线(图9)。细胞被thapsigargin处理后，在含有3µM thapsigargin的孔中，gq介导的钙信号减少了约75%，而在较低thapsigargin浓度下，钙信号似乎不受影响。

添加thapsigargin 6小时后，钙信号在所有处理浓度下都减少了，在最低浓度(1 nM)时减少了约50%，在含有3.0至0.1 μ M thapsigargin的孔中下降到无法检测到的水平。24小时后，Gq介导的钙信号进一步减弱，1.0 nM thapsigargin处理条件下钙信号较初始反应降低约75%。

治疗24小时后，定量分析thapsigargin对gq依赖性钙信号传导的剂量依赖性效应，产生了IC₅₀值为25 nM(图10)。综合这些结果表明，与诱导的细胞应激反应相比，thapsigargin以相当低的浓度抑制HEK293中gq介导的信号传导，且抑制时间更长。

图9。评估thapsigarin诱导的24小时内gq依赖性钙信号通路的抑制作用。(A) HEK 293内的钙动员是由注射30 μ M (final)卡巴胆碱(一种hM1激动剂)到生长培养基中引发的，在使用该蛋白处理细胞后立即(B)在该蛋白处理后6小时，(C)在该蛋白处理后24小时。

图10。thapsigargin对gq介导的钙信号的剂量依赖性作用。用治疗24小时后R-GECO荧光的折叠变化计算IC₅₀值为25 nM。

只监测应激细胞内的钙信号

细胞应激研究的结果表明，thapsigargin浓度的增加导致内质网应激或UPR被激活的细胞数量的增加。为了将钙信号的作用与细胞应激水平直接关联起来，使用Gen5图像分析工具仅在使用thapsigargin治疗6小时后显示细胞应激的细胞中测量钙诱导的R-GECO荧光变化。应激细胞被进一步归类为高应激水平或低应激水平的细胞，并对每个亚群的gq介导的钙信号动力学图谱进行比较(图11)。有趣的是，与应激水平较低的细胞相比，表现出最高水平应激的细胞在被卡巴醇激活后，胞质钙水平似乎有更大的相对增加。这些结果在一定程度上可能是由于更严重的应激细胞表现出聚集形态，这在相关的高对比度亮场图像中显示。

监测细胞应激和毒性及其对细胞信号传导的影响对于理解疾病病理学和药物发现和开发过程都很重要。这项研究展示了实时监测活细胞中的细胞压力的能力，同时检查细胞压力对第二信使信号的影响。使用Montana Molecular和Agilent BioTek Lionheart FX的细胞应激测定法，开发了2022世界杯附加赛决赛一种通过监测应激细胞在种群中的百分比来检测细胞应激的高含量读出器。该方法可用于测定细胞应激和细胞增殖对SERCA泵抑制剂thapsigargin的响应。

图11。亚群体分析，只评估显示细胞应激的细胞内的钙信号。亚群体分析用于定义应激细胞，显示高水平的应激(黄色面具)或低水平的应激(蓝色面具)。(a)在卡巴醇刺激前加入0.1 μM thapsigargin 6小时和(b)注射卡巴醇6秒后应激细胞的数量。(c)细胞核内的静息钙水平，以及在添加卡巴醇后钙水平的增加，被测量为两个亚群的细胞。

结论

结果显示，thapsigargin诱导的细胞应激在细胞增殖发生任何变化之前被检测到一个数量级。细胞应力水平的动力学监测显示了应力传感器的可逆性。应激水平在治疗6 - 7小时后达到峰值，但细胞在22小时后从这种应激中自然恢复，与先前报道的细胞应激反应与thapsigargin治疗相匹配。¹⁶然而，同时分析Gq信号表明，apsigargin治疗改变了Gq介导的Ca^{2 +}即使内质网应激反应得到了缓解，信号也没有发生变化。Gq-dependent Ca^{2 +}信号转导在治疗6和24小时均以剂量依赖性的方式减少，表明内质网应激对gq介导的Ca^{2 +}即使在细胞关闭内质网应激反应机制后，信号仍然存在。这些数据突出了安捷伦BioTek Lionheart FX自动显微镜的一个重要特征，即监测长期和短2022世界杯附加赛决赛期动力学反应的能力，并展示了细胞应激和钙的多路复用能力的重要性^{2 +}狮心FX上的生物传感器。

最后，该试验的一个关键特征是能够在一个群体中识别应激细胞和非应激细胞，并分别询问这些细胞。细胞应力传感器被用于从一组经thapsigargin处理的细胞中识别应激细胞和非应激细胞，并监测其独特的gq介导的Ca^{2 +}信号响应。当只有一小部分细胞处于应激状态，需要分离出来进行分析时，这些类型的分析将非常重要，就像许多神经退行性疾病，如帕金森氏症或亨廷顿氏病一样。总之，本研究开发的高含量测定法使用安捷伦BioTek Lionheart FX和Montana Molecular的细胞应力传感器来分析细胞应力是一种快速、可靠的定量测量细胞应力及其对细胞第2022世界杯附加赛决赛二信使信号的影响的方法。

参考文献

1. Grootjans, J.等。免疫和炎症中的未折叠蛋白反应。免疫学杂志2016,16,469-484。
2. Scheper w;神经退行性疾病中的未折叠蛋白反应:一个神经病理学的视角。神经病理学杂志，2015,130,315-331。
3. Zeeshan, h.m.a.等人。内质网应激与相关ROS。Int。中华分子生物学杂志，2016,17,327。
4. 肌醇要求酶1α是恶性胶质瘤血管生成和侵袭的关键调节因子。Proc。国家的。学会科学。美国，2010,107,15553-15558。
5. Kammoun, H. L.等。GRP78表达抑制胰岛素和内质网应激诱导的SREBP-1c激活，减少小鼠肝脏脂肪变性。j .中国。投资。2009,119,1201-1215。
6. 工藤，T.等。分子伴侣诱导剂保护神经元免受内质网应激。细胞死亡差异。2007,15,364。
7. 黄，R.等。模拟Tox21 - 10k化学剖面，用于体内毒性预测和机制表征。Nat. comm2016, 7,10425。
8. Kim, e.c.等人。保护角膜内皮细胞抵抗未折叠蛋白反应和氧化应激药物的筛选和表征。投资。角膜切削。科学通报2017,58,892-900。
9. Plate, L.等。重组ER以减少细胞外蛋白质聚集的小分子蛋白酶调节剂。Elife 2016, 5。
10. 罗斯，D. M.等。调节不良应激反应以管理蛋白质折叠疾病。中国生物医学工程学报，2014,12,e1001998。
11. 迪瓦尔，D. G.等。药物诱导氧化应激和毒性。中华化学杂志，2012,645460。
12. Foufelle f;内质网应激在药物毒性中的作用。杂志。2016, 4, e00211。
13. Iwawaki, T.等。监测内质网应激的转基因小鼠模型。中华医学杂志2004,10,98-102。
14. 容，J.等。基于细胞的高通量荧光素酶报告基因分析，用于识别和分析内质网信号蛋白IRE1的化学调节剂。j . Biomol。屏幕。2015,20,1232-1245。
15. 赵颖，等。基因编码Ca2+指示器的扩展调色板。科学2011,333。
16. van Schadewijk, A.等。一种检测剪接X-box结合蛋白-1 (XBP1) mRNA作为内质网(ER)应激的定量方法。细胞应激伴侣2012,17,275-279。