人淋巴细胞分泌IL-2的刺激

使用Lionheart LX自动显微镜对ELISPOT银染色分析成像

作者: Paul Held，博士，BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT USA应用部门实验室经理

淋巴细胞被用于多个研究领域，包括自身免疫性疾病、传染病、疫苗开发和恶性血液病。ELISPOT检测监测体外细胞免疫对抗原刺激的反应。虽然最初的ELISPOT检测使用PVDF膜板，但最近的检测格式已经发展到使用银染色过程，允许使用透明的底板。这里我们使用狮心王™LX自动显微镜与Gen5™Microplate Reader和Imager Software使用银染色ELISPOT分析格式定量Jurkat细胞中IL-2分泌的变化。

简介

细胞因子是许多细胞类型(特别是免疫系统细胞)分泌的小分子量蛋白质或多肽，调节免疫反应的持续时间和强度。细胞因子白细胞介素2 (IL-2)是一种多效细胞调节分子，由淋巴细胞在对多种刺激作出反应时产生。通过促进未成熟T细胞向调节性T细胞分化，发挥预防自身免疫性疾病的作用^[1]．此外，当原T细胞受到抗原刺激时，它会使T细胞分化为效应T细胞和记忆T细胞^[２]．

t细胞的激活通常是由细胞表面受体与其特定的配体分子以及共刺激分子的相互作用启动的^[3]．这一结合事件触发了磷脂酶C (PLC)快速水解肌醇磷脂为二酰甘油和肌醇磷酸。

图1所示。刺激IL-2分泌的信号级联示意图。

二酰基甘油是蛋白激酶C (PKC)活化和肌醇磷酸的变构激活剂，可触发Ca++的释放和动员，导致额外的细胞反应级联介导t细胞活化。其中一种细胞反应是IL-2的产生和分泌。雷公藤甲素是一种二萜三氧化二酯，是一种有效的免疫抑制剂和抗炎剂。雷公藤甲素已被证明在嘌呤盒/核因子和NF-κB介导的转录激活水平上抑制活化T细胞中IL-2的表达。(图1)。^[4]

虽然Jurkat细胞是一种已知会产生IL-2的白血病t细胞系，但在正常生长条件下几乎不会产生IL-2。只有在刺激后，大量的细胞因子才会表达^［5］．植物血凝素(PHA)是一种凝集素，它与糖基化表面蛋白(包括T细胞受体(TCR))上的糖结合，并非特异性地结合它们。结果是低水平刺激IL-2分泌所需的信号级联^[6]．同样，肉豆蔻酸酯(PMA)是一种小型有机化合物，其结构类似于二酰基甘油，扩散通过细胞膜进入细胞质，在那里它直接激活蛋白激酶C (PKC)，与离子霉素结合使用，一个钙离子载体，触发钙释放也会产生低水平的信号。然而，当PMA和PHA等共刺激因子同时刺激Jurkat细胞IL-2时，IL-2的产量会显著提高^[7]．

银点ELISPOT的检测过程与传统的ELISPOT非常相似。这些平板首先被涂上适当的捕获抗体。将培养的分泌细胞与实验用的有丝分裂原或抗原一起加入孔中。细胞维持一段时间，之后被取出。分析物仍然与捕获的抗体结合在培养皿上分泌分析物的细胞所在的位置附近。去除细胞和任何未结合的物质后，加入生物素化检测抗体，然后加入酶偶联物孵育，使其结合并清洗，以去除未结合的物质。在原始分析物捕获的位置，用沉积银的基底形成斑点。然后通过图像分析分析/计数生成的斑点(图2)。

图2。ELISPOT银染色法。

与本研究中使用的ELISPOT分析方法的主要区别是，微板使用透明膜，允许使用倒置几何显微镜来量化银点。这就允许使用狮心王™LX自动显微镜。

材料与方法

人IL-2 ELISPOT银染色试剂盒来自UCyTech生物科学公司(乌得勒支，荷兰)。福波尔12-肉豆蔻酸酯(PMA)， cat# (P8139, phytohemagglutin- L (PHA)， cat#11249738001和雷公藤甲素(cat # XXXX)购自Millipore-Sigma。离子霉素(cat# 407952)来自EMD-Millipore。Jurkat细胞(人淋巴瘤)来自ATCC。

细胞培养

Jurkat细胞在rmi -1640 + 10% FBS + 2 mM谷氨酰胺、青霉素和链霉素中培养。悬液细胞每2 ~ 3天以1:5与新鲜培养基分离。在实验中，除非另有说明，细胞以1 × 105/孔的密度镀于96孔板中，之前涂有IL-2抗体。PMA (50 ng/mL)、离子霉素(1 μg/mL)和PHA (1 μg/mL)联合刺激Jurkat细胞分泌IL-2。

Triptolide抑制

Jurkat细胞在体积为50 μL的RPMI完整培养基中以1 × 105/孔的速率被镀。细胞在37℃、5% CO2的潮湿环境中恢复1小时后，将雷公藤甲素以4倍终浓度的完整RPMI培养基中50 μL添加到每孔中。雷公藤甲素作用1小时后，以100 μL加入IL-2刺激剂(2x)，终量为200 μL。刺激24小时后，用ELISPOT试剂盒检测培养皿。

ELISPOT试验

这些实验使用了U-CyTech生物科学公司的人IL-2 ELISPOT试剂盒。根据试剂盒说明进行分析。简单地说，首先在平板上涂上适当浓度的捕获抗体，并在4°C下吸附一夜。将未结合的抗体吸出，用PBS手动清洗3倍。然后用阻塞溶液(200 μL)填充孔，并在室温下孵育至少1小时。将培养的Jurkat细胞与实验用的有丝分裂原或抑制剂一起加入孔中，总体积为200 μL。细胞保持24小时后，使用MultiFlo™FX多模式分色器用250 μL pbs -吐温0.05%冲洗6倍去除细胞。将生物素化检测抗体(100 μL)加入孔中，37°C孵育60分钟，洗去未结合的检测抗体。加入链霉亲和素-氨基丁酸共轭物(100 μL)， 37°C孵育60分钟。再次，通过清洗去除未结合的共轭物，然后添加两组分基板，使银颗粒沉积在井底。 Reactions are halted after 60 minutes at RT by washing with deionized water (250 μL) 3x and allowed to dry. Entire wells were then imaged.

洗盘子

根据检测试剂盒的说明，用a试剂清洗培养皿MultiFlo™外汇洗衣机分配器(BioTek Instruments。洗缓冲液为PBS (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 7.4 mM)，添加0.05%吐温20。除非有特别说明，否则每孔用250 μL缓冲液洗涤6次。

板成像

培养细胞使用配备增强亮场的Lionheart™LX自动显微镜(BioTek Instruments, Winooski, VT)成像。该成像仪使用LED光源结合带通滤波器和二色镜来提供适当波长的光。使用4倍物镜拍摄了一系列图像，以创建蒙太奇(4x5)，覆盖了整个井。使用Gen5™中的亮场双峰自动对焦程序自动聚焦图像。

分析

蒙太奇瓷砖(每井20个)首先缝合到一个单一的图像文件之前，背景减法。背景减去后，根据阈值和大小标准识别目标(表1)。

表1．ELISPOT定量的图像处理和图像分析参数。

结果

初步实验证明了ELISPOT反应的特异性。如图3所示，被PMA/离子霉素和PHA联合刺激的Jurkat细胞显示出大量斑点，而未被刺激的细胞几乎不会产生银斑。没有Jurkat细胞的单独治疗也不会产生任何斑点。

图3。IL-2 elisa反应的特异性。elisa孔中Jurkat细胞经PMA (1 ng/mL)、Ionomycin (1 μg/mL)和PHA (1 μg/mL)处理或未处理的图像。阴性对照，缺乏细胞，但接受了兴奋剂。

结合酶将底物转化而沉积的银会在光背景下产生非常暗的斑点。人们注意到，在斑点数量较多的井中，斑点的强度会减弱。这种情况的根本原因很可能是井内试剂的耗尽。为了在这些情况下捕获所有的斑点，所有的实验都使用了15000的阈值。图4描述了阈值与几口井的阳性物之间的关系。

图4．物体平均强度与物体数量的散点图。在一个典型的实验中，从7个独立的井中得到的所有阳性物体的物体平均强度与物体指定数作对比。15 000的正阈值标准用红线表示。

识别对象的正确大小对于准确的测定是至关重要的。ELISPOT试验的目的是识别和量化对特定刺激产生反应的细胞数量。抗体涂层板捕获的是它的特定目标，而不是实际的分泌细胞。虽然大多数分泌的分析物会被捕获在细胞位置附近的区域，但一些分析物会扩散到培养基中并捕获在其他地方。细胞附近高浓度的分析物会形成与细胞物理尺寸一样大或更大的斑点，而分散的分析物则会形成非常小的银矿床。由于沉积银粒的密度非常高，因此选择适当大小的点是至关重要的。图5显示了典型ELISPOT井中1 μm或更大密度银颗粒的数量。只有尺寸超过50 μm的斑点才被指定为真斑点。

图5．物体大小与物体数量的散点图。所有达到阈值15000且大于1 μm的点都与它们的指定编号对应。标记为阳性的斑点(大小为>50 μm)用红色表示。

被刺激细胞产生的记录斑点的数量与分泌细胞的数量成正比。当滴定的Jurkat细胞暴露于固定浓度的刺激物中时，计数的斑点数量与细胞数量成正比。如图6所示，井中细胞数量的增加会导致计数点数量的增加。每孔细胞数超过2万个时，斑点会聚集在一起。后续的实验使用了每孔10000个细胞。

图6。Jurkat细胞滴定法。将不同浓度的Jurkat细胞接种到ELISPOT平板中，分别用50 ng/ mL PMA、1 μg/mL离子霉素和30 μg/mL PHA刺激24小时。然后检测ELISPOT板的IL-2分泌。数据点表示8次测定的平均值。

刺激Jurkat细胞后IL-2的分泌具有时间依赖性。在刺激后的头两个小时内几乎没有观察到任何斑点。最大的分泌量，由斑点数量决定，在大约8-10小时的刺激物存在后观察到。进一步的暴露并没有导致观察到的斑点数量增加(图7)。

图7。刺激暴露时间对IL-2分泌的影响。Jurkat细胞暴露于50 ng/mL PMA、1 μg/mL离子霉素和30 μg/mL PHA不同时间，然后用elisa法测定IL-2分泌。数据点表示6次测定的平均值。

PMA、离子霉素和PHA的混合物对IL-2分泌的刺激是剂量依赖性的。如图8所示，当连续稀释复方混合物刺激IL-2分泌时，随着稀释度的增加(浓度越低)，elisa法检测IL-2时观察到的斑点越少。

图8．刺激混合物滴定。Jurkat细胞用不同稀释的PMA/离子霉素和PHA混合物在涂有IL-2抗体的ELISPOT平板上刺激24小时。浓度以最高浓度的百分比表示(50 ng/ mL PMA, 1 μg/mL离子霉素，30 μg/mL PHA)。刺激后评估IL-2分泌并计数斑点。数据点表示6次测定的平均值。

在刺激前用雷公藤甲素预处理Jurkat细胞1小时，以剂量依赖性的方式减少IL-2的分泌。如图9所示，雷公藤甲素浓度的增加导致IL-2分泌细胞的斑点减少。在这些实验中，刺激剂量是最大剂量的80%。的集成电路₅₀在此条件下测定其浓度为40 nM，与文献报道相似^[8]．

图9。雷公藤甲素抑制IL-2分泌。用不同浓度的雷公藤甲素预培养60分钟后，用6 ng/mL PMA、0.125 μg/mL离子霉素和3.7 μg/mL PHA刺激Jurkat细胞分泌IL-2。24小时后elisa板检测IL-2分泌情况。数据表示7个数据点的平均值。

讨论

这些数据证明了Lionheart™LX自动化显微镜与Gen5™Microplate Reader和Imager软件相结合，对银染色的ELISPOT检测板进行成像和分析的实用性。在培养的Jurkat细胞中，PHA/离子霉素和PHA的结合已被证明能显著刺激IL-2的分泌。如果没有刺激，IL-2几乎是不存在的。IL-2分泌的刺激既需要时间又需要时间。雷公藤甲素，一种已知的转录抑制剂，能够阻止IL-2的分泌，这表明刺激后需要新的蛋白质合成。

ELISPOT是一种敏感的检测方法，通过检测细胞释放的分泌蛋白，在单细胞水平监测体外细胞免疫反应。该技术源于夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)，以适应使用整个细胞来识别分泌细胞的频率。因此，为了使实验成功，有许多关键参数需要优化。根据细胞分泌的程度，发育的斑点可能相当大。预期的阳性细胞数量比最初使用的细胞总数更重要。过多的分泌细胞的存在会导致单个斑点的合并，使数值测定变得困难。例如，与更常见的分泌事件相比，研究一个相对罕见的分泌事件将需要更多的细胞被植入。反应相对于刺激和/或抑制的时间是很重要的。受体介导的事件通常比细胞内直接相互作用的刺激分子要花更长的时间才能引起反应。在刺激和测量之间使用适当的间隔是很重要的。 The testing of inhibitors still requires a stimulating agent to be present. In these experiments, it is important that a less than maximal concentration of the stimulatory agent be used, lest it mask any inhibitory affects.

Lionheart LX是解释银染色ELISPOT试验的理想平台。该成像仪支持显微镜成像，目标从1.25倍到100倍，可以安装在一个6位物镜炮塔。虽然这项研究只使用了明亮场照明，但成像仪支持基于荧光的LED和滤光立方体显微镜。Gen5 Microplate Reader and Imager Software除了可以控制读取器功能外，还可以自动对单独的蒙太奇图像瓦片进行拼接，在分析之前进行背景减法和屏蔽井外区域。

参考文献

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