人外周血单个核细胞的刺激

使用安捷伦BioTe2022世界杯附加赛决赛k Cytation 7细胞成像多模式阅读器对ELISpot检测进行成像和分析

作者:保罗·赫尔德博士安捷伦科技公司

摘要

人类外周血单个核细胞(PBMCs)通常从血液样本中分离出来，然后用于一些研究领域，包括自身免疫疾病、传染病、疫苗开发和癌症。ELISpot检测监测抗原刺激的体外细胞免疫反应。这里我们使用安捷伦BioTek2022世界杯附加赛决赛2022年世界杯抽签 细胞成像多模式阅读器与安捷伦BioTek Gen5微板阅读器和成像软件结合使用比色elisa法定量P2022世界杯附加赛决赛BMCs中细胞因子分泌的变化。

简介

人外周血单个核细胞(PBMCs)受到不同的刺激，分泌多种细胞因子，这是基于细胞类型和刺激的受体介导级联的结果。这种不同细胞群对不同刺激的反应为它们在疾病中的作用和治疗方式的发展提供了深刻的见解。

PBMCs是具有圆形细胞核的外周血细胞。¹这些细胞包括淋巴细胞(T细胞、B细胞和nk细胞)和单核细胞。其他的外周血细胞要么没有细胞核(红细胞和血小板)，要么有多裂核(中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)。在人类中，淋巴细胞构成了PBMC的大多数，其次是单核细胞，只有一小部分树突状细胞。²

细胞因子是许多细胞类型(特别是免疫系统细胞)分泌的小分子量蛋白质或多肽，调节免疫反应的持续时间和强度。细胞因子白细胞介素2 (IL-2)是一种多效细胞调节分子，由淋巴细胞在对多种刺激作出反应时产生。通过促进未成熟T细胞向调节性T细胞分化，发挥预防自身免疫性疾病的作用。^3.此外，当原T细胞受到抗原刺激时，IL-2可使T细胞分化为效应T细胞和记忆T细胞。⁴干扰素γ (IFN-γ)是一种对感染的先天和适应性免疫至关重要的细胞因子。作为先天免疫反应的一部分，IFN-γ主要由自然杀伤细胞(NK)和自然杀伤T细胞(NKT)产生，一旦抗原特异性免疫形成，则由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应T细胞产生。⁵IFN-γ在免疫系统中的重要性部分源于其直接抑制病毒复制的能力，以及其免疫刺激和免疫调节作用。IFN-γ表达异常与许多自身炎症和自身免疫疾病相关。

t细胞的激活通常是由细胞表面受体与其特定的配体分子以及共刺激分子的相互作用启动的。⁶这一结合事件触发了磷脂酶C (PLC)快速水解肌醇磷脂为二酰甘油和肌醇磷酸。

二酰基甘油是蛋白激酶C (PKC)的变构激活剂。PKC激活和肌醇磷酸，触发Ca^{2 +}释放和动员，导致额外的细胞反应级联介导T细胞激活(图1)。其中两种细胞反应是IL-2和INF-γ的产生和分泌。雷公藤甲素是一种二萜三氧化二酯，是一种有效的免疫抑制剂和抗炎剂(图2)。雷公藤甲素已被证明可以在嘌呤盒/核因子和NF-κB介导的转录激活水平上抑制激活T细胞中IL-2的表达。⁷

图1．刺激IL-2和INF-γ分泌的信号级联示意图。

图2。雷公藤甲素的结构。

虽然已知一些pbmc产生IL-2和INF-γ，但在正常生长条件下很少产生。只有在刺激之后，大量的细胞因子才会被表达出来。⁸植物血凝素(PHA)是一种凝集素，它与糖基化表面蛋白(包括T细胞受体(TCR))上的糖结合，并非特异性地结合它们。其结果是IL-2或INF-γ分泌所需的信号级联的低水平刺激。⁹同样，肉豆蔻酸酯(PMA)是一种小型有机化合物，其结构类似于双酰基甘油，扩散通过细胞膜进入细胞质，在那里它直接激活蛋白激酶C (PKC)。当与离子霉素(一种钙离子载体)联合使用时，它会引发钙的释放，导致适度水平的细胞因子释放。然而，当PMA和PHA等共刺激物同时刺激PBMC细胞时，细胞因子的产生会强烈增强。¹⁰

ELISpot的检测过程与传统的ELISA非常相似。这些平板首先被涂上适当的捕获抗体。将培养的分泌细胞与感兴趣的实验有丝分裂原或抗原一起加入孔中。细胞维持一段时间，之后被取出。分泌的分析物仍然与捕获的抗体结合在培养皿上产生分析物的细胞所在的位置附近。在去除细胞和任何未结合的物质后，添加检测抗体(通常是生物素化的)，然后添加酶偶联物，孵育使其结合，并在每一步后清洗以去除未结合的物质。当底物被结合酶转化为有色化合物时，在板膜底部原始分析物捕获位置上形成斑点。然后利用图像分析对生成的斑点进行分析/计数。(图3)。

图3．ELISpot染色法。

实验

材料与方法

人IL-2 ELISpot比色试剂盒来自U-CyTech生物科学公司(乌得勒支，荷兰)，双色人IFN-γ/IL-2 ELISpot试剂盒来自Cellular Technology Limited公司(Cleveland, OH)。福波尔12-肉豆蔻酸酯(PMA)和雷公藤甲素(零件号T3652)购自Millipore-Sigma。离子霉素(部分编号407952)来自EMD-Millipore。人pbmc从Astarte Biologicals公司(Bothell, WA)获得。96孔白色PVDP膜(零件号MSIP4W10)来自Millipore-Sigma。

细胞培养:接收纯化的人pbmc并保持冷冻直到需要。快速解冻后立即用RPMI-1640 + 10% FBS(添加2 mM谷氨酰胺、青霉素和链霉素)1:10稀释细胞。细胞以300克离心10分钟，取上清。细胞重悬于10 mL新鲜RPMI培养基中，计数并按需要稀释，以提供5 × 10的密度⁴细胞/。

板涂层:这些实验使用了U-CyTech生物科学公司的人IL-2 ELISpot试剂盒或CTL公司的2色人INF-γ/IL-2试剂盒。PVDF膜板首先涂上适当浓度的捕获抗体(抗il -2或抗ftn -γ)，并在4℃下吸附一夜。将未结合的抗体吸出，用PBS手动清洗3倍。然后用阻塞溶液(200 L)填充孔，并在室温下孵育至少1小时。在加入细胞前立即吸入阻塞缓冲液而无需清洗。

细胞培养:除非另有说明，细胞被镀在96孔的膜板上，之前涂有抗体，密度为5 × 104 /孔。PMA (50 ng/mL)、离子霉素(1µg/mL)混合液刺激PBMCs分泌IL-2。典型的实验使用100µL的细胞体积，然后加入100µL的2倍浓度的刺激剂混合物。

Triptolide抑制:pbmc以5 × 10的温度被镀⁴50 μ L体积的完整RPMI介质。让细胞在37°C, 5%的湿润CO中恢复1小时后₂将雷公藤甲素在完整RPMI培养基中以4倍终浓度添加到每孔50 μ L。将IL-2刺激物混合物(2x)加入100µL，最终体积为200µL。

单色elisa法测定:根据U-Cytech BioSciences试剂盒说明进行分析。播种后，细胞在37°C的5%湿润CO中孵育24小时₂然后用ELISpot试剂盒进行检测。简单地说，使用Agilent BioTek MultiFlo FX多模分配器，用250µL pbs -吐温0.05%洗涤5倍，去除细胞。2022世界杯附加赛决赛将生物素化检测抗体(100 μ L)加入孔中，37℃孵育60分钟或5℃孵育过夜，然后通过清洗去除未结合的检测抗体。然后加入链霉菌生成素- hrp偶联物(100µL)， 37°C孵育60分钟。再次，通过洗涤除去未结合的共轭物。然后添加两部分AEC基板，将染料沉积到井膜底部。用去离子水(250 μ L) 3倍使用MultiFlo FX在RT下洗涤30分钟后停止反应，并在黑暗中干燥。然后对整口井进行成像。

双色elisa试剂盒的研制:根据ct . L. Immunospot 2-color ELISpot试剂盒说明书进行检测。播种后，细胞在37°C的5%湿润CO中孵育24小时₂然后用ELISpot试剂盒检测环境板。简单地说，使用MultiFlo FX多模分配器，用250 μ L pbs -吐温0.05%洗涤5倍去除细胞。在孔中加入检测抗体溶液(80 μ L/孔)，室温孵育120分钟，洗去未结合的检测抗体。加入第三溶液(80 μ L/孔)，在rt下孵育60分钟。用pbs -吐温洗涤2次，然后用dH洗涤2次，除去未反应的试剂₂然后在黑暗中晾干。然后加入蓝色显影液(80 μ L/孔)，rt孵育15分钟。用dH洗涤3倍后停止反应₂O.加入红色显影液(80 μ L/孔)，RT孵育7分钟。盘子是洗过的3倍带dH的₂底片在成像前在黑暗中风干至少2小时。

洗盘子

根据检测试剂盒说明书使用MultiFlo清洗机(BioTek Instruments)清洗培养皿。洗涤缓冲液为PBS (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na₂HPO₄10 mM, KH₂阿宝₄7.4 mM)添加0.05% Tween 20。除非有特别说明，否则每孔用250 μL缓冲液清洗5次。

板成像:制备的微板使用配置有直立彩色相机的cyation细胞成像多模式阅读器进行成像。该成像仪使用白色LED光源与彩色数码相机相结合。为了在一帧内对整个井进行成像，使用2x镜头拍摄了一系列图像。一旦手动确定了焦平面和相机曝光，图像就会自动捕获，使用Gen5中的反射光，使用固定的焦高度例行程序。

表1。图像捕获和预处理参数。

分析

表2．图像分析参数。

结果与讨论

初步实验证明了ELISpot反应的特异性。PMA/离子霉素联合刺激的pbmc产生大量斑点，而未受刺激的细胞产生的斑点很少。没有PBMCs的单独治疗不会产生任何斑点。

图4．IL-2 elisa反应的特异性。含PMA处理(1 ng/mL)和离子霉素处理(1µg/mL)的pbmc的ELISpot孔图像。阴性对照，缺乏细胞，但接受了兴奋剂。

对已识别物体的正确大小是准确测定的必要条件。ELISpot试验的目的是识别和量化对特定刺激产生反应的细胞数量。抗体涂层板捕获的是它的特定目标，而不是实际的分泌细胞。虽然大部分分泌的分析物会被捕获在细胞位置附近的区域，但一些分析物会扩散到培养基中并被捕获到其他地方。细胞附近高浓度的分析物将导致一个与细胞物理尺寸一样大或更大的斑点，而分散的分析物将导致非常小的强度沉积。图5显示了典型ELISpot井中出现的斑点数量。只有大小超过25 μ m的斑点才被指定为真斑点。

图5。物体大小与红色密度的散点图。所有达到绿色阈值7000的地点都比它们的指定编号多。25 μ m的尺寸阈值用蓝色垂线表示。

被刺激细胞产生的记录斑点的数量与分泌细胞的数量成正比。当滴定的pbmc暴露于固定浓度的刺激物时，计数的斑点数量与细胞数量成正比。如图6所示，井中细胞数量的增加会导致计数斑点的增加。当每孔细胞数超过5万个时，斑点就会聚集在一起。随后的实验使用了每孔5000个细胞。

图6。细胞滴定。将不同浓度的PBMC接种到ELISpot平板中，用50 ng/mL PMA、1µg/mL离子霉素刺激24小时。然后检测ELISpot板的IL-2分泌。数据点表示8次测定的平均值。

PMA和离子型霉素的混合物对IL-2分泌的刺激是剂量依赖性的。如图7所示，PMA浓度的增加会产生更多的斑点。

图7。PMA滴定刺激。PBMCs(5000个细胞/孔)用不同稀释的PMA和1µg/mL离子霉素在IL-2抗体包被的ELISpot平板上刺激24小时。刺激后评估IL-2分泌并计数斑点。数据点表示7次测定的平均值。

在刺激前用雷公藤甲素预处理pbmc 1小时可减少IL-2的分泌，且呈剂量依赖性。如图8所示，雷公藤甲素浓度的增加导致IL-2分泌细胞的斑点减少。在这些实验中，刺激剂量是最大剂量的80%。的集成电路₅₀在此条件下测定其浓度为40 nM，与文献报道相似⁸．

图8。雷公藤甲素抑制IL-2分泌。用不同浓度的雷公藤甲素预孵育pbmc(5000细胞/孔)60分钟，用6 ng/mL PMA、1µg/mL离子霉素刺激分泌IL-2。24小时后elisa板检测IL-2分泌情况。数据表示7个数据点的平均值。

多重ELISpot测定法可同时定量许多不同的分析物。虽然有几种基于荧光的分析方法可以在单孔中提供最多4种分析物的信息，但比色elisa法每孔只能提供2种分析物。使用针对人类IL-2和IFN-γ的双色elisa试剂盒进行的初步实验表明，该方法在特异性识别IL-2或IFN-γ分泌细胞方面具有特异性。在这个实验中，分泌IL-2的细胞可以通过形成蓝色斑点看到，而分泌IFN-γ的细胞形成红色斑点。对照实验中观察到(图9)，涂有抗il -2抗体的孔只形成蓝色斑点，而只涂有抗ifn -γ抗体的孔只形成红色斑点。接受了两种涂层抗体的孔形成了红色和蓝色的斑点，而缺乏PBMCs或PMA刺激的细胞没有形成任何斑点。

图9。双分析物ELISpot检测的特异性。有PBMC的ELISpot孔的图像，PBMC被PMA处理或不处理(10 ng/mL)。孔膜被IL-2和IFN-γ特异性抗体所覆盖，IL-2或IFN-γ或两者都产生了颜色。阴性对照，缺乏细胞，但接受了兴奋剂。

区分红色和蓝色的斑点可以通过斑点的红色和蓝色密度的差异来实现。图10中的直方图显示了纯红色和纯蓝色对照井之间计算的红/蓝密度比的差异。红蓝比的均值加上其标准差的两倍，可以作为纯红点的上限。同样，蓝点控制的均值减去两个标准差定义了蓝点的红/蓝比的下限。在这两个阈值之间具有比值值的点被认为是蓝色和红色的。

图10．红蓝ELISpot强度比值的频率直方图分析。红蓝比值的频率从8只红和只蓝控制井。均值和均值±2倍的总体标准差表示。

这些阈值可用于定量单色反应，其中只有IL-2或IFN-γ反应发生。如图11所示，当PMA刺激PBMCs时，IL-2和IFN-γ细胞因子都被分泌。刺激与EC以浓度依赖的方式发生₅₀非常相似的值(EC₅₀= 0.05 ng / mL)。有趣的是，根据斑点计数，与IL-2相比，有两倍多的pbmc可能分泌IFN-γ。

图11。PMA刺激后PBMCs分泌IL-2和IFN-γ的比较。PMA在PVDF膜ELISpot板中刺激PBMCs，同时包被IL-2和IFN-γ捕获抗体。24小时后，印版加工和颜色显影在平行井。斑点(红色和蓝色)被定量并绘制为PMA浓度的函数。数据表示重复井的平均值和标准差。

当两种颜色使用相同的标准开发时，可以在同一井中进行多重、两色分析。图12显示了几口不同颜色井的数据的频率直方图。当用肉眼检查图像时，井中的大多数点都有明显的红色或蓝色的斑点，有一小部分是混合色。这些观察结果被图12所示的频率直方图所证实，该直方图表明所识别的点具有红/蓝比率值的光谱。根据红蓝比，有两个明显的峰值，对应于只出现一种颜色时观察到的红蓝点。在它们各自的截止值之间是具有中间红/蓝比例的大量点。

图12．ELISpot红蓝比值的频率直方图。两色elisa检测板上8孔elisa斑点的红蓝比被绘制为频率的函数。基于红、蓝或红、蓝点截点的亚种群分析用颜色表示。

这些明显对应紫色的斑点(即红色和蓝色的混合物)。识别为红色或蓝色的斑点的相对数量与单一颜色形成时识别的数量相似。当一个人用一个比较红/蓝比率和斑点大小的散点图来分析数据时，观察到两个与红或蓝点对应的松散的斑点簇，以及一些中间比率的斑点(图13)。尽管这三种子种群的斑点大小范围相同，但红色斑点往往比蓝色斑点数量更多、尺寸更小。

图13。ELISpot红蓝比值散点图。两色ELISpot检测板上8孔的ELISpot斑点的红蓝比被绘制为大小的函数。提出了基于红、蓝、红、蓝点截断值的亚种群分析方法。

这种多重分析可用于具有不同实验条件的单井。图14显示了PBMCs对PMA刺激的反应，其中蓝色(IL-2)和红色(IFN-γ)在同一阱中产生。与单色发育一样，PMA以浓度依赖性的方式刺激PBMCs上的细胞因子分泌。同时，PBMCs分泌IFN-γ多于IL-2, EC相同₅₀值。如果比较分泌IFN-γ的细胞总数(只分泌红点加上红和蓝点)或分泌IL-2的细胞总数(只分泌蓝点加上红和蓝点)，其数字与只分泌一种颜色的孔一致。

图14。受刺激PBMCs中IL-2和IFN-γ分泌的比较。使用预涂有抗il -2和抗ifn -γ抗体的PVDF膜96孔板，用不同浓度的PMA刺激PBMCs。ELISpot处理后，对板孔进行成像，用Gen5进行图像分析。亚群体分析定义了红、蓝或红蓝混合的点。每个点亚种群的数量与PMA浓度的关系。数据表示4个测定值的平均值和标准差。

讨论

这些数据证明了安捷伦BioTek Cytation 7细胞成像多模式读取器与安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek Gen5微板读取器和成像软件一起成像和分析比色PVDF ELISpot分析板的实用性。PMA/离子型霉素的组合已被证明能显著刺激PBMCs中IL-2的分泌。如果没有刺激，IL-2几乎是不存在的。雷公藤甲素，一种已知的转录抑制剂，能够阻止IL-2的分泌，这表明刺激后需要新的蛋白质合成。¹¹

ELISpot是一种敏感的检测方法，通过检测细胞释放的分泌蛋白，在单细胞水平监测体外细胞免疫反应。该技术源于夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)，以适应使用整个细胞来识别分泌细胞的频率。因此，为了使实验成功，有许多关键参数需要优化。根据细胞分泌的程度，发育的斑点可能相当大。预期的阳性细胞数量比最初使用的细胞总数更重要。过多的分泌细胞的存在会导致单个斑点的合并，使数值测定变得困难。例如，与更常见的分泌事件相比，研究一个相对罕见的分泌事件将需要更多的细胞被植入。反应相对于刺激和/或抑制的时间是很重要的。受体介导的事件通常比细胞内直接相互作用的刺激分子要花更长的时间才能引起反应。在刺激和测量之间使用适当的间隔是很重要的。 The testing of inhibitors still requires a stimulating agent to be present. In these experiments, it is important that a less than maximal concentration of the stimulatory agent be used, lest it mask any inhibitory affects.

Cytation 7是解释比色法PVDF膜ELISpot检测的理想平台。该成像仪支持数字自顶向下彩色成像与2x, 4倍和8倍显微镜物镜的工厂安装。2倍物镜可以在一张图像中捕获整个井，使其非常适合96口井的ELISpot测定。如果需要，可以通过使用更高的放大物镜和蒙太奇的井获得更高的分辨率。使用这种相机，无论是反射光还是透射光都可以用于最佳成像。虽然本研究仅使用了带有PVDF膜板的垂直自顶向下相机，但该成像仪也支持使用倒置相机进行银染色ELISpot检测的明亮场成像。此外，倒置显微镜支持荧光显微镜与LED和过滤立方体。Gen5微板读取器和成像器软件除了可以控制读取器功能外，还可以在分析前自动进行单独蒙太奇图像瓦片的拼接，进行背景减影和屏蔽井外区域。

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