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荧光偏振法快速测定IgG

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2017年9月15日

使用安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek多模式酶标仪定量溶液中的IgG


作者: Paul Held，博士，安捷伦科技公司

摘要

准确、快速和高通量的IgG测量在大多数治疗性抗体的开发和后续制造中是必不可少的，因为单克隆抗体在生物制药中越来越占主导地位。本应用说明描述了Agilent BioTek Synergy Neo2混合多模式阅读器的使用，2022世界杯附加赛决赛快速确定IgG浓度，使用荧光偏振为基础的ValitaTITER检测试剂盒提供Valitacell．

简介

抗体生产在过去十年中急剧上升，因为生物制剂，尤其是单克隆抗体，已经成为一个重要的治疗平台。据估计，2017年生物制剂占全球药品市场价值的19-20%[1]．此外，抗体更传统的用途也在稳步增加。酶联免疫吸附法(ELISA)于1971年首次提出，它使用附着在固体底物上的特异性抗体来捕获和定量分析物[２]．蛋白质免疫印迹，通常被称为western blots，是一种广泛使用的分析技术，用于检测已被聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的样品中的特定蛋白质[3]．免疫组化和免疫荧光利用特异性抗体来检测和标记细胞和组织切片内的特异性蛋白质，然后可以根据标签使用光或荧光显微镜进行观察。所有这些技术都极大地得益于1975年首次描述的单克隆抗体的出现，它允许无限地生产特定抗体[4]．

IgG分子(单克隆或多克隆)是所有上述技术的主要制剂。免疫球蛋白G (IgG)是人类五类免疫球蛋白(IgM、IgD、IgG、IgA和IgE)中的主要一类。IgG抗体由四个不同的亚类组成，它们的氨基酸含量和免疫功能各不相同［5］．为了评估IgG抗体的产生或优化IgG产生的细胞生长条件，必须准确地测定IgG的浓度。

有几种不同的方法来定量抗体蛋白。HPLC Protein-A柱浓缩和纯化的抗体去除所有介质成分，允许在280 nm处使用吸光度测量。生物分子层干涉测量法使用光波干涉来估计与传感器结合的物质的数量[6]．微凝集试验使用抗IgG多克隆抗体增敏的微球，随着IgG数量的增加而逐渐凝集[7]．接近性分析，如SPARCL[8], HTRF®[9]，以及FRET-PINCER®[10]是混合和读取分析，使用针对IgG的抗体对，使试剂靠近，以便在没有任何洗涤步骤的情况下产生可测量的反应。ELISA反应将IgG结合到固体底物上，允许在检测之前去除未结合的和不需要的物质[11]．虽然所有方法都以自己的方式有效，但每种方法在必要的样品制备、仪器要求和处理所需的时间方面都存在缺陷，这限制了它们在抗体生产过程样品中的有效性。

在这里，我们描述了一种适用于在生物制药关键路径的发现、细胞系发育和过程阶段测量任何IgG或IgG变体浓度的通用检测方法。该方法简单、快速、低成本且易于自动化。

分析的基础上

Valita™TITER检测方法是一种混合读取检测方法，适用于高样品通量操作(图1)。它依赖于荧光偏振(FP)检测IgG Fc与荧光素标记蛋白G的相互作用[12]．G蛋白是一种表达于G族链球菌中的免疫球蛋白结合蛋白，能够通过Fab区和Fc区结合IgG。天然蛋白G (G148)具有天然白蛋白结合位点，经选择性克隆去除[13]．荧光偏振(FP)是一种基于观察荧光分子在平面偏振光激发下发出平面偏振光的荧光技术。在溶液中，蛋白质可以自由旋转，因此发射的偏振光平面可以根据所讨论的荧光团的荧光寿命和分子在该时间段内经历的旋转程度而改变。分子转速受溶液粘度、绝对温度、分子体积和气体常数的影响。如果保持粘度和温度恒定，那么转速差异的关键变量是分子体积，或者近似地说是分子量。

Valita™TITER荧光偏振检测原理

图1所示。Valita™TITER荧光偏振检测原理荧光素标记的蛋白G(示踪剂)预涂在Valita™MAb板的孔中。添加Valita™MAb Buffer可使示踪剂重新悬浮。加入标准品或含有IgG的样品会被示踪剂结合:标准品/样品中IgG含量越多，平面偏振光激发的偏振越大。

FP通过测量分子/复合物在溶液中旋转的速度，有效地分析了它们的大小。因此，当荧光标记的蛋白G被解结合时，它会迅速翻滚，并且比与IgG结合时(大5倍)的光去极化更严重。这种极化的变化可以用来测量蛋白质G的结合程度，从而测量溶液中IgG的数量。FP的测量方法是用平面偏振光刺激溶液，并测量平行于激发光(偏振光比例)和垂直于激发光(去偏振光部分)的平面中发射的光的强度。FP表示为这两个强度的归一化差，通常以毫偏振单位(mP)表示。

Synergy™Neo2是一款混合多模式阅读器(BioTek Instruments, Inc.)，具有专利的混合技术™，将基于过滤器和基于单色仪的检测系统结合在一个单元中。多模式阅读器可以适应吸光度(UV-Vis)，荧光，发光和AlphaScreen™检测方式。此外，该阅读器具有时间分辨荧光(TRF)和荧光偏振(FP)功能。在FP的情况下，阅读器使用基于滤波器的激发和发射滤波器、偏振器和二向色镜系统，结合高性能氙气闪光灯和双匹配光电倍增管(PMT)，同时检测平行和垂直荧光发射。

材料与方法

纯化的小鼠IgG1和IgG2b样本以及杂交瘤细胞系的相应上清液是绿山抗体公司(Burlington, VT)的慷慨礼物。此外，几种不同种类的IgG，包括山羊(I-5326);兔子(i - 5006);牛(i - 5508);人类(i - 4508);老鼠(i - 4131);鼠标(i - 5381);猪(i - 4531);绵羊(I-5131)以粉状形式从Millipore-Sigma中获得，并溶解在添加10%胎牛血清(FBS)、青霉素和链霉素抗生素的RPMI培养基中。Valita™TITER检测试剂盒来自Valitacell (Dublin, Ireland www.valitacell.com)。

标准是根据各自的产品说明书制定使用的。从几种不同动物中提取的市售纯化IgG，用培养基重组至5 mg/mL的浓度。部分原液用培养基进一步稀释至100 μg/mL。以介质为稀释剂，进行系列(1:2)稀释，制备一系列标准品。将Valita™MAb Buffer (60 μL)与60 μL IgG标准品移液到Valita™MAb板的每孔中。内容物混合后在黑暗中孵育30分钟，然后在BioTek Synergy Neo2上读取。

读取器的控制和数据采集使用Gen5数据分析软件(BioTek Instruments)。FP测量使用深度阻塞滤波器，激发为485/20 nm，发射为528/20 nm，同时使用510 nm的二向色镜和偏振滤波器。所使用的仪器设置如表1所示。

平板读数参数

表1。板读数参数。

为了尽量减少测量中的实验差异，FP数据使用G因子进行调整，以返回110 mP的游离未结合蛋白G示踪剂值。数据绘制为仅使用示踪剂标准的极化变化，并由Gen5软件应用4参数逻辑拟合。

结果

使用小鼠单克隆IgG1同型连续稀释法评估Valita™TITER测定培养基中IgG的能力。如图2所示，IgG浓度的增加导致返回极化值的增加。

典型IgG标准曲线。

图2。典型IgG标准曲线。使用Valita™TITER法对先前使用比色蛋白法定量的纯化小鼠IgG进行稀释。极化的变化被绘制出来，并应用了一个4参数的逻辑拟合。数据点表示3个数据点的均值和标准差。

这项技术与使用高效液相色谱法作为定量IgG分子的手段相比具有优势。当使用Valita™TITER和HPLC方法对类似样品进行分析时，可以观察到计算浓度之间的线性关系(图3)。HPLC通常被认为是生物制药行业中测定IgG的金标准方法。结果表明，Valita™TITER和HPLC之间高度相关(R2=0.9926)。

Valita™TITER与HPLC。

图3。Valita™TITER与HPLC。使用“金标准”蛋白A高效液相色谱法和Valita™TITER检测系统对来自细胞培养上清的一系列“中”IgG样本进行定量。每种方法的结果浓度相互对照，并对数据进行线性回归。

虽然绝大多数单克隆抗体来自小鼠、大鼠和兔子物种，但多克隆抗体来自任何数量的哺乳动物供体。如图4所示，Valita™TITER检测方法能够检测和定量我们测试的任何哺乳动物物种。反应的差异可能是蛋白质G示踪剂结合差异的综合结果，以及报道的商业来源的IgG浓度的偏差和冻干粉的增溶性。

物种的比较

图4。物种的比较。几种不同种类的市售IgG被稀释并使用Valita™TITER试剂盒进行分析。极化的变化被绘制出来，并应用了一个4参数的逻辑拟合。数据点表示3个数据点的均值和标准差。

蛋白G示踪剂的特异性如图5所示。使用Valita™TITER试剂盒测定人IgG和IgM的稀释度，并绘制由此产生的极化变化。随着抗体浓度的增加，人IgG有超过100个mP单位的变化，而IgM几乎没有导致极化的变化。由于FP本质上是一种测量大小变化的测定，因此可以推断测定示踪剂不与IgM结合也不检测IgM。

人IgG vs IgM信号。

图5．人IgG vs IgM信号。使用Valita™TITER法测定人IgG和人IgM稀释。

BioTek提供了许多不同的多模式读取器选项，以满足不同研究人员的需求。图6展示了不同读取器之间测定的可重复性，每个读取器具有不同的荧光光学，以进行偏振测量。当使用三个不同的读取器确定来自同一板的样品的荧光偏振时，基本上相同的响应曲线返回。

读者比较。

图6。读者比较。使用BioTek Multimode Microplate读取器测定了人IgG滴定的偏振值，这些读数代表了不同的光学设计。绘制极化变化，应用4参数logistic拟合并确定EC50值。数据点表示4个数据点的均值和标准差。

讨论

这些数据证明了Valita™TITER检测与BioTek Multimode阅读器结合使用，可快速定量混合样品中的IgG浓度。IgG抗体的产生在生物医学研究和生产中已得到广泛应用。从混合样品中快速确定IgG浓度的能力在生产过程中作为生产速度的评估和最终浓度的测定特别重要。细胞培养基通常含有动物血清、盐类、辅助因子和细胞生长所必需的氨基酸，当评估培养基上清液时，它们的存在往往妨碍使用传统的比色法或荧光法蛋白质测定。只有通过纯化(如柱层析)除去这些成分，才能使用这些方法。Valita™TITER检测允许直接定量的IgG从工艺样品，无需样品准备或通常不稀释。

Valita™TITER assay和Synergy™Neo2 Hybrid Multi-Mode Reader的组合为最终用户提供了许多功能。FP计算可以直接使用BioTek的Gen5™Microplate Reader和Imager软件进行。另外，可以将平行和垂直荧光测量导入Valita™App软件，该软件允许将样品结果和标准FP结果存储在数据库中，从而进行趋势分析。

BioTek根据最终用户的需求和预算提供了许多不同的多模式阅读器选项。Synergy Neo2通过使用多个pmt同时进行并行和垂直测量，提供快速测定。Synergy 2和Synergy H1按顺序测量平行和垂直信号，而Cytation™1除了其基于pmt的平板读取功能外，还提供了对样品进行数字显微图像分析的能力。

所有BioTek阅读器都配有Gen5 Microplate Reader和Imager Software (BioTek Instruments)，该软件控制阅读器功能，收集和存储生成的数据，并执行数据还原。许多不同的曲线拟合可用于描述数据或用作插值的标准曲线，以计算未知的样本浓度。对于GMP环境，该软件可作为具有ISO 21 CRF第11部分符合性的安全版本，包括密码保护，基于用户的特权和电子签名。

参考文献

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