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用荧光偏振法快速测定临界胶束浓度

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9月18日


洗涤剂的理化性质分析

作者:Paul Held博士，实验室经理，应用部门，BioTek仪器公司，维诺斯基，VT

表面活性剂在不同环境条件下的临界胶束浓度(CMC)值的测定对于许多不同的生物和化学过程是重要的。因为CMC不是一个恒定的值，随着不同的环境条件而变化，所以重要的是要有一种快速、可靠和简单的方法来促进测试。在这里，我们描述了用荧光偏振快速半自动测定384孔微板中表面活性剂的CMC值。

简介

表面活性剂是两亲性化合物，其分子结构同时包含亲水(亲水)和疏水(憎水)区域。疏水区域通常是长链脂肪烃，而亲水部分可以由离子或非离子极性基团组成。这些分子的物理性质赋予了降低溶液表面张力的能力，并能自聚集成称为胶束的胶体。

胶束是表面活性剂分子在胶状悬浮液中的聚集物。典型的胶束在水溶液中形成，亲水的头部区域与水接触，疏水的脂肪族尾部区域埋在胶束的内部部分。有用的表面活性剂在水溶液中具有一定的可溶性，只有当它们达到足够的浓度时才聚集成胶束。这个浓度被称为临界胶束浓度(CMC)(图1)。CMC以下不存在胶束，溶液的表面张力随着表面活性剂的增加而降低，渗透压随着表面活性剂的增加而增加。在CMC浓度以上，未聚集表面活性剂的浓度保持不变，胶束数量随着表面活性剂总浓度的增加而增加。随着表面活性剂浓度的增加，溶液浊度和增溶性增加。一旦达到CMC，表面张力随表面活性剂浓度的变化显著减小或随着表面活性剂浓度的进一步增加而消除。

胶束形成示意图。

图1所示。胶束形成示意图。

两亲性表面活性剂除了降低表面张力外，还有许多特性，通常根据用途进行标记(例如肥皂、洗涤剂、润湿剂、分散剂、乳化剂、发泡剂、杀菌剂、缓蚀剂、抗静电剂等)。虽然商业上是根据它们的用途进行分类的，但科学上是根据它们在水中的解离性进行分类的。阴离子表面活性剂在水中解离成两亲性阴离子。电荷)和一个简单的阳离子(如Na+， K+)。阴离子表面活性剂是最常用的表面活性剂，约占世界产量[1]的50%。

非离子表面活性剂约占所有表面活性剂的45%。这些试剂在溶液中不电离，通常具有由醇、酚、醚、酯或酰胺组成的亲水基团。许多非离子表面活性剂含有聚乙二醇链。阳离子表面活性剂在水溶液中形成两亲性阳离子和阴离子。通常这一类含有氮化合物，如与一个或多个长链烷基疏水基团相连的季铵脂肪胺盐。

由于制造成本高，这类产品不太受欢迎，只有在找不到更便宜的替代品时才会使用。通常它们被用作杀菌剂、抗静电剂和缓蚀剂。当一个表面活性剂分子同时含有阴离子和阳离子的解离性时，它被称为两性或两性离子。这些化合物包括合成甜菜碱或磺基甜菜碱和天然物质，如氨基酸和磷脂。

在表面活性剂CMC值的预测方面已经做了大量的工作。在合成新化合物之前准确预测CMC，可以定制表面活性剂以满足特定需求。对于某些类型的表面活性剂，预测CMC在规定条件下与观测值吻合得很好，主要是在简单水溶液中。利用经验关系建立了表面活性剂结构与CMC之间的数学关系。线性六氧基烷基酯[14]中CMC的对数与烷烃碳原子数之间的线性关系最为显著。热力学模型也被用来预测各种表面活性剂[17]的CMC。最近，一种系统的定量结构-性质关系(QSPR)方法允许为更多类别的表面活性剂[18]生成预测建模方程。尽管在许多条件下预测表面活性剂的行为做出了努力，但确定CMC的唯一方法是凭经验来做。

临界胶束浓度已实验确定使用了许多不同的方法。采用苯甲酰丙酮(BZA)的紫外光谱法测定了CMC[13]。BZA溶于水时存在于酮和烯醇互变异构体的平衡混合物中。在CMC表面活性剂的存在下，烯醇互变异构体的数量急剧增加，烯醇形式分裂到胶团[13]的内部部分。脂溶性染料如Hoechst 33342[6]或尼罗红[7]在疏水环境中表现出增强的荧光，例如当胶束开始形成时，染料在其疏水核心中分离。尼罗红在不同溶剂中的光谱漂移也被用来监测胶束形成[8]。荧光化合物芘表现出5个主要的振动荧光峰，这取决于溶剂。峰1和峰3的荧光强度之比反映了局部环境。表面活性剂的芘1:3比例滴定图生成递减的s型曲线。表面活性剂浓度低于胶束浓度会导致极性环境，表明峰值1与峰值3的比值很高。 As surfactant concentrations increase and approach the CMC, the pyrene 1:3 ratio begins to decrease rapidly to reaching a new lower constant value that reflect the 1:3 ratio at surfactant concentrations above the CMC [9].

除了荧光方法外，还利用电导率[10]的变化、光散射[11]的增加，甚至固体电极[12]，来确定溶液中表面活性剂分子的临界胶束浓度。

经修饰后与胶束相互作用的荧光分子的荧光偏振可用于表面活性剂[3]的CMC测定。5-十二氨基荧光素(DAF)本质上是一种连接到脂肪族尾的荧光探针，它可以插入胶束内部区域，但不会完全浸入胶束内部。通过这样做，荧光化合物DAF的有效分子体积是胶束的有效分子体积，明显大于单独的亲脂性探针。因此，转速差可以利用荧光偏振测量。

荧光偏振(FP)是一种荧光检测技术，由Perrin[2]在1926年首次提出。这是基于观察到荧光分子在偏振光激发下会发出偏振光。在溶液中，发射光的偏振与分子的转速成反比，转速受分子体积或近似分子量的影响。荧光偏振是使用通过两个偏振滤光片返回的荧光发射的比率来测量的，一个平行(ǁ)和一个垂直(┴)到偏振兴奋光的平面。荧光偏振(P)使用以下公式计算，其中G是仪器和检测相关的校正因子。

Eq - 1。

数据通常乘以1000并表示为毫偏振(mP)。

CMC计算:

在这些实验中产生的荧光偏振数据产生了一个s型曲线，可以用4参数logistic曲线拟合[5]来描述

情商2。

其中变量y对应于给定表面活性剂浓度在浓度x时的极化值，a是较低浓度时的理论响应，B是曲线在其拐点处的相对斜率，C是拐点处的浓度值，D是最高浓度时的响应。

而从实验区计算CMC值有多种不同的方法。一种最初描述为与芘1:3方法[4]一起使用的方法，利用截取曲线的快速变化部分和曲线[3]的近水平低浓度部分。这种方法可以修改，以使用荧光偏振观察到的递增的s型曲线(图2)。

乙形图测定CMC的原理图。

图2。乙形图测定CMC的原理图。

在4参数logistic拟合中，切线的斜率可以用方程来描述

情商3。

其中LS为LogSlope, LSb为直线的y轴截距。LogSlope (LS)可以从4参数logistic方程的各个参数中计算出来，该方程用于描述原始数据

情商4。

根据公式，利用拐点提供的信息计算LSb。

情商5。

如前所述，CMC值是曲线的较低水平部分与切线之间的交集(Ix)。因此

情商6。

结果值的反对数就是计算出的CMC值。

材料与方法

表面活性剂多米芬溴化钠(P/N 247480)、十二烷基硫酸钠(P/N L4509)、N-苄基-N、N-二甲基-1 -十二烷基氯化钠(P/N 13380)、十四烷基硫酸钠(P/N293938)、十二烷基硫酸钠(P/N 71443)、Niaproof®4 (P/N N1404)、辛基硫酸钠(P/N O4003)、Ipegal 630 (P/N 18896)、Triton X-100 (T8787)、聚山梨酯20 (P/N P1379)、聚山梨酯40 (P/N P1504)、聚山梨酯60 (P/N 95754)、聚山梨酯80 (P/N 59924)、zwittergent (P/N T7763)从Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州)购买。这些表面活性剂化合物的原液是在milliq水中制成的。纯黑色384孔微孔板(3573)来自康宁公司(Corning, NY)， 5-十二氨基荧光素(P/N D109)购买于Life Technologies。制备5倍Hepes缓冲液原液(125 mM pH 8.0)和2.5倍氯化钠溶液(0.25%，2.5%和25% w/v)，过滤消毒并在室温下保存。

分析在384孔板中进行，这样不同的化合物稀释剂、荧光染色剂、缓冲成分和盐浓度可以互换使用。试剂以5倍或2.5倍溶液加入，以达到预期的最终浓度。每日从200 mM原液中新鲜配制复方稀释液，手动移液(15 μL)至微板中。复合滴定后，使用MultiFlo™自动分配器(BioTek Instruments, Winooski VT)上的注射泵加入5倍Hepes反应缓冲液(pH 8.0)溶液(15 μL)。然后立即加入氯化钠溶液(30 μL)MultiFloperipump分发器。对于需要多种盐浓度的实验，8管蠕动泵的不同管子从不同的试剂库中抽出。孵育3分钟后，使用MultiFlo注射泵分配器加入15 μL DAF荧光染料(5 μM)。在孵育20分钟后，用a测量荧光偏振协同™Neo(BioTek Instruments, Winooski, VT)。平行和垂直读数同时使用过滤器立方体4和61与485/20激发和528/25发射滤波器。分析流程如图3所示。

CMC测定测定流程。

图3。CMC测定测定流程。

使用Gen5™数据分析软件(BioTek Instruments)控制读取器并捕获数据。利用g因子调整荧光偏振数据的实验差异，得到游离游离DAF示踪剂的值为29 mP。数据自动绘制为4参数logistic拟合，由Gen5软件计算CMC。

结果

不同的表面活性剂分子比较，曲线形状和CMC值明显不同。在测试的分子中，非离子聚山梨酸酯20 (Tween 20)具有最低的CMC，而十二烷基硫酸钠(SDS)在更高的摩尔浓度下形成胶束。

荧光偏振法测定表面活性剂CMC的比较。并绘制了DAF的荧光偏振与洗涤剂浓度的函数关系。

图4。荧光偏振法测定表面活性剂CMC的比较。并绘制了DAF的荧光偏振与洗涤剂浓度的函数关系。

除了胶束开始形成时的浓度差异外，重要的是要注意，尽管将100%未结合的示踪剂极化孔校正到相同的值，但每种化合物存在胶束时的极化值是非常不同的。这表明每种表面活性剂形成了不同大小的胶束。

氯化钠浓度对多米芬溴化CMC的影响。在不同浓度的氯化钠溶液中，用溴化多菲芬化合物滴定法测定了DAF的荧光偏振。

图5。氯化钠浓度对多米芬溴化CMC的影响。在不同浓度的氯化钠溶液中，用溴化多菲芬化合物滴定法测定了DAF的荧光偏振。

许多表面活性剂形成胶束的浓度受氯化钠浓度的影响。如图5所示，荧光偏振曲线和推断多米芬溴化的CMC受氯化钠存在量的影响。极化显著增加，这表明胶束的形成发生在较低浓度的钠离子和氯离子的存在。每种浓度的CMC可以用数学方法确定(表1)，与无盐值相比的倍数变化是氯化钠浓度的函数(图6)。随着氯化钠浓度的增加，多米芬溴化钠的CMC减少了近50倍。然而，这种巨大的影响对所有表面活性剂都不均匀，因为聚山梨酯20受氯化钠变化的影响最小。这是毫无疑问的，因为它是非离子洗涤剂，所以盐不会影响胶束的形成到相同的程度。

测定了不同氯化钠浓度下多米芬溴化铵的CMC值。

表1。测定了不同氯化钠浓度下多米芬溴化铵的CMC值。

氢离子浓度对胶束的形成也有重要影响。如图7所示。与中性pH相比，SDS和Ipegal 630受氢离子浓度的影响要小得多，在pH 5.5到9.0之间几乎没有变化。

不同表面活性剂的盐效比较。

图6。不同表面活性剂的盐效比较。在不同浓度的洗涤剂和氯化钠的存在下，测定了DAF的荧光偏振。CMC值相对于无盐对照的倍数变化，然后绘制为氯化钠浓度的函数。

由于分子的亲水极性区域依赖于分子的电离状态，因此像多米芬溴化这样的带正电荷的分子肯定会受到氢离子浓度的影响，并且它们在低pH值下形成胶束的有效性并不令人惊讶。非离子洗涤剂(如Ipegal 630)对氢离子浓度的变化更有抵抗力。有些令人惊讶的是，CMC对带负电荷的SDS的电阻随测试的pH值而变化。尽管在pH为9.0时，SDS的折叠变化略有下降，这表明在较高的pH值下，表面活性剂浓度显著降低时，胶束可能形成。

pH对两亲性表面活性剂CMC值的影响。

图7。pH对两亲性表面活性剂CMC值的影响。在不同pH水平下，使用几种洗涤剂和磷酸盐缓冲液测定了DAF的荧光偏振。计算每种化合物在每个pH值下的CMC，并绘制从pH 7.0开始的倍数变化。

除了表面活性剂分子的亲水头部部分外，疏水脂肪族“尾巴”也会影响不同表面活性剂的CMC。当三种烷基硫酸盐化合物只在脂肪族尾的长度上有所不同时，可以观察到CMC的显著差异。在这些例子中，脂肪族尾每增加2个碳，CMC大约减少10倍(图8)。癸基硫酸钠(C10)在浓度为40.085 mM时形成胶束，而十四烷基硫酸钠(C14)的CMC为0.904 mM(表2)。

季胺表面活性剂对脂肪族侧链的影响。测定并绘制了DAF在三种四元化合物滴定下的荧光偏振。

图8。季胺表面活性剂对脂肪族侧链的影响。测定并绘制了DAF在三种四元化合物滴定下的荧光偏振。

随着尾巴长度的增加，CMC减少了10倍，这不是一个绝对现象。如图9所示，对三种不同的聚山楂酸酯表面活性剂进行比较，在具有不同长度脂肪族尾的分子中，只观察到CMC的微小差异。聚山楂酯20和60的尾长分别为12和18，尽管尾长增加了6个碳，但CMC减少了约2倍。除长度外，脂肪族尾的结构对CMC也有显著影响。脂肪族烃尾部的分支导致胶束形成所需浓度的大幅增加。如图10所示，两种烷基硫酸盐化合物NiaProof®4和十四烷基硫酸钠具有明显不同的CMC值，尽管它们具有相同的配方重量和相同的脂肪族尾中的碳氢化合物数量。NiaProof®4在脂肪族尾部有几个侧链，而硫酸十四烷基则没有(见附录A)。胶束中分支的紧密分子的破坏最有可能是导致CMC值较高的原因。

脂肪族侧链长度对聚山梨酯类化合物的影响。

图9。脂肪族侧链长度对聚山梨酯类化合物的影响。

多晶硅表面活性剂对脂肪族侧链双键结构的影响。

图10。多晶硅表面活性剂对脂肪族侧链双键结构的影响。

此外，双键的存在并不显著影响与聚山梨酸酯化合物形成胶束(图11)。聚山梨酸酯60和聚山梨酸酯80的不同在于脂肪族尾中存在双键连接(见附录)。当计算CMC值时，只观察到非常小的差异(表2)。

测定了具有不同脂肪族尾的Quat和聚山梨酸酯表面活性剂的CMC值。

表2。测定了具有不同脂肪族尾的Quat和聚山梨酸酯表面活性剂的CMC值。

图11。多晶硅表面活性剂对脂肪族侧链双键结构的影响。

讨论

表面活性剂的临界胶束浓度(CMC)是一个重要的物理参数。当表面活性剂的浓度高于CMC时，它们可以作为乳化剂，使通常不混溶的化合物溶解在溶剂中。通常不溶性化合物被隔离在胶束核心中，而头部基团与溶剂相互作用。这方面最显著的例子是洗涤剂的使用，水溶性差的“污垢”，即油和蜡，可以通过水中的表面活性剂去除，而单靠水通常不能去除它们。

在不同条件下，表面活性剂分子极头区的大小和结构类型对表面活性剂的CMC有重要影响。小离子头通常形成胶束在更高的摩尔浓度比表面活性剂与大的非离子化合物。虽然增加脂肪族尾长会降低表面活性剂的CMC值，但具有小极性头的化合物受脂肪族尾长影响的程度要比具有大非离子极性区的表面活性剂大得多。经测试的离子烷基硫酸盐化合物显示，每增加2个碳长度，CMC减少约10倍。非离子洗涤剂，如简单聚氧乙烯(如Triton X-100)或聚氧乙烯(如聚山梨酸酯20)，是聚氧乙烯衍生物，表现出更适度的下降。

许多非离子表面活性剂的制剂通常是略有不同的化合物的混合物，氧乙烯基的数目表示为平均值。所有的多山梨醇总共有20个氧乙烯基与山梨醇糖相连(见附录)，不同之处是脂肪酸尾，由名称中的数字指定。Ipegal 630和Triton X-100，虽然在文献中有不同的名称和描述的用途，但本质上是相同的分子，具有大约9个氧乙烯基(见附录)。许多研究表明，乙醇乙氧基酯的头尺寸直接影响CMC。磁头大小与环氧乙烷的数量成正比[16]。在任何一类分子中，与带正电的Quat化合物或带负电的SDS的离子极性区域相比，极性头结构都相对较大。这些化合物的CMC似乎受脂肪族尾巴长度的影响要小得多。

氯化钠对胶团形成的影响是双重的。氯化钠显著降低了多米芬等离子表面活性剂的CMC。此外，在CMC以上的表面活性剂在盐的存在下极化值高于无盐的表面活性剂，这表明胶束聚集的尺寸更大。使用非离子表面活性剂时，胶束大小也略有增加。这种大小的增加可以表现为每个胶束中平均有更多的分子，或者由于离子力而使胶束膨胀。

这些数据表明，使用DAF荧光偏振法测定表面活性剂的CMC值不仅简单、准确，而且可以很容易地扩展到大样本量。与荧光强度不同，荧光偏振使用每孔两次测量的比值，校正由实验条件(如pH值、温度和表面活性剂浓度)带来的强度差异。Synergy Neo阅读器是一款高通量阅读器，专为大量样品的测量而设计。该阅读器使用模块化光学立方体来测量多种读取模式，包括UV-Vis吸光度，发光，荧光强度，时间分辨荧光，HTRF®，AlphaScreen®和荧光偏振。关于荧光偏振，阅读器能够同时确定平行和垂直测量。Gen5™软件(BioTek仪器)不仅控制读取器功能，而且能够自动执行4参数逻辑拟合和计算CMC值。

参考文献

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确认

我要感谢Eddie Delpierre (BioTek仪器公司)和Sara Held(佛蒙特州社区学院)在4参数逻辑拟合方程中CMC值的数学确定方面的帮助。

AN00904_14


附录

表面活性剂化合物的结构


apendix

链接