活细胞抗氧化活性的定量评估

作者: Paul Held，博士安捷伦科技公司Winooski, VT，美国;Damien Brechet Agilent Technologies SAS Les Ulis，法国;Christophe Furger, Camille Gironde, Mylene Rigal，和Wenli Debord抗氧化能力(AOP)图卢兹，法国

使用安捷伦BioTe2022世界杯附加赛决赛k Cytation 5细胞成像多模式阅读器

摘要

抗氧化功率1 (AOP1)是一种抗氧化活细胞检测方法，由发光细胞系统(LUCS)技术发展而来，该技术可对活性氧(ROS)的产生进行精细监测。AOP1是基于激活细胞内光敏剂的一种方案，只需要连续的闪光和荧光读数。然而，光感应过程需要高能闪光，通常由外部光源设备提供。在本应用说明中，使用槲皮素，一种具有活细胞抗氧化作用的经典标准化合物，首次表明，使用安捷伦BioTek可以在“即插即用”模式下实现AOP1检测2022世界杯附加赛决赛2022世界杯南美区预选赛 细胞成像多模式阅读器。槲皮素在人肝HepG2细胞上进行了剂量效应研究。细胞抗氧化指数(CAI) 50%功效浓度(EC₅₀)µM为15.70和15.78,R²分别为0.996和0.994，与之前发表的数据一致。

简介

植物被认为是抗氧化提取物/化合物的无数来源，几十年来，学术界和工业界都在深入研究这种多样性，寻找抗氧化的“圣杯”。然而，大多数研究都是在脱细胞环境中进行的试管抗氧化测定，没有给出关于活生物体中真正预期的抗氧化效果的线索。直到最近，二氯二氢荧光素二乙酸(DCFH-DA)是细胞模型上唯一可用的抗氧化作用检测生物传感器。在过去，这种检测方法(也称为CAA)已经被证明很难标准化，并且仍然存在许多缺陷。这些缺点包括:缺乏对ROS产生水平的控制，缺乏对抗氧化和细胞毒性效应的区分，细胞渗漏，对粘附细胞的限制，以及自氧化，这些都极大地限制了其作为一种可靠的定量分析方法的价值。本应用笔记描述了AOP1试验，如图1所示。

图1所示。AOP1化验。(1)光诱导前，噻唑橙(TO)通过外排转运蛋白从细胞中去除;(2)光作用下，能量从TO转移到处于三元态的分子氧，形成单态氧和随后的自由基(ROS)。(3) ROS改变外排转运和其他细胞功能;(4) TO进入细胞核引起荧光发射增加。作用的衡量标准是抗氧化剂抑制ROS产生的能力，将to挡在细胞外，导致低荧光。^3.

这一新的抗氧化活细胞试验源于发现了一种光敏剂，即噻唑橙(TO)，它能够发射与细胞产生的ROS的实际浓度相关的信号。TO的荧光量子产率Φ仍然很低(2 × 10⁴)，因为它的两个芳香环围绕连接它们的甲基桥自由旋转，如图2所示。

图2。噻唑橙色结构。

在这些条件下，能量弛豫在激发态下通过超快分子内扭转(100 fs)的内部转换以非辐射模式发生。这意味着在光敏剂到达细胞内目标之前，几乎没有残留的TO荧光。TO还可以与核酸相互作用，使其荧光量子产率增加500倍，这归因于其扭转能力的限制。¹最近在HepG2细胞中进行的一项电子顺磁共振(EPR)研究表明，激发的TO也可以作为一种经典的光敏剂产生两者¹O₂(II型反应)和OH•(I型反应)。²

最后，TO在活细胞中呈现出另一种独特的特性:它的荧光水平在被称为LUCS的光诱导过程中升高。隐藏在LUCS背后的密切机制已经部分被破译。虽然TO被动地进入细胞，但它主要是通过外排转运蛋白(可能属于MATE家族)去除，限制了它与核酸的接触，导致荧光水平低。当光线照射时，由TO光激活诱导的ROS改变外排和/或其他细胞功能，扰乱细胞内稳态，触发生物传感器进入，逐渐饱和核酸结合位点，导致相应的荧光水平升高。抗氧化效果(例如，中和细胞内自由基的能力)可以通过提取物/样品延迟或抑制ros诱导的荧光增加的能力来衡量，如图1所示。据我们所知，AOP1是第一个能够评估和量化活细胞直接产生的自由基猝灭的方法。⁴细胞ROS水平可以精确控制，保持在亚致死水平，并通过简单的荧光测量量化。

AOP1分析法已经成功地应用于根据药效浓度(ECs)对许多标准抗氧化剂进行分类。⁴；评估许多植物提取物的细胞抗氧化作用，包括越桔植物复合体(越桔)⁵；作为药理学研究中的生物传感器^6、7．

实验

材料

HepG2细胞系(部件号HB8065)购买于美国类型培养集合(ATCC) (LGC标准，Molsheim, France)。DMEM高葡萄糖(部件编号11965092)、青霉素-链霉素(10000 U/mL)溶液(部件编号15140122)、谷氨酰胺补充剂(部件编号35050061)和丙酮酸钠(部件编号11360070)均来自Gibco/Life Technologies (Carlsbad, CA)。HyClone胎牛血清(FBS)和HyClone 0.05%胰蛋白酶EDTA来自Thermo Fisher Scientific SAS (Illkirch- Graffenstaden, France)。槲皮素(零件号Q4951)来自Sigma-Aldrich (Fallavier, France)。AOP1试剂盒(零件号K-1001)来自Anti Oxidant Power (Toulouse, France)。

细胞培养

HepG2细胞培养于37°C/5% CO₂在谷氨酰胺DMEM培养基中，添加10%胎牛血清和1x青霉素-链霉素溶液。将细胞培养到70% ~ 80%的合流度，然后转移到透明底部的96孔微板上，浓度为75 μL, 7.5万个细胞/孔，24小时。

试验协议

通过连续两倍稀释得到9种不同浓度(1.95 ~ 500 μM)的槲皮素。实验在96孔微板中进行。所有细胞处理均在无血清培养基中进行，以避免与血清成分的潜在相互作用。每种实验条件均为三次，包括无样品溶剂对照。细胞在37℃5% CO中孵育4小时₂对每个实验条件。将A溶液(来自AOP1试剂盒，零件号K-1001)添加到细胞中，在37°C和5% CO中放置30分钟₂．孵育后，每2分钟动态测量荧光水平，分两步进行。

使用505 nm激发和535 nm发射波长测量荧光，紧接着用Cytation 5显像灯照射500毫秒，强度为1，带有GFP滤波器。这个荧光读数/照明循环被设置为重复同一循环18次，如图3所示。

图3。动力学检测方案。使用505 nm激发和535 nm发射波长测量荧光，紧接着用Agilent BioTek Cytation 5细胞成像多模读取器成像灯照射500毫秒，强度为1，带有GFP滤波器。2022世界杯附加赛决赛这个循环(荧光读数/照明)被设置为重复相同的循环18次。

仪表

数据收集在Agilent BioTek Cytati2022世界杯附加赛决赛on 5细胞成像多模式阅读器上，该阅读器配置了一个GFP成像滤镜立方体和一个4倍物镜，由Agilent BioTek Gen5微板阅读器和成像软件控制。

方法

分析

原始动力学数据从Gen5导出，并使用Prism 8软件绘制(GraphPad, San Diego, CA, USA)。绘制原始数据(相对荧光单位，RFUs)随时间变化的曲线。原始动力学图经过归一化处理，使每个实验条件以未处理(1% DMSO)对照井的百分比表示。这些转换后的数据也被绘制成时间的函数。利用各归一化动力学曲线的积分计算每个样品的CAI。CAI根据公式1计算，其中X为归一化相对荧光，CTL为归一化对照井的平均值。

然后用CAI值计算50%疗效浓度(EC₅₀)的值，由Prism 8生成的数学非线性回归模型(sigmoid拟合)得到，公式2中，Hill slope为拐点切线的斜率系数。电子商务₅₀和决定系数R²从回归模型推导出数值。

结果与讨论

这些数据证明了AOP1测定法能够动态监测to荧光的变化。如图4所示，HepG2细胞经槲皮素处理4小时后，再用AOP1试剂孵育，根据槲皮素浓度的不同，显示出明显不同的荧光图谱。未经处理的细胞在20分钟内荧光增加近20倍，表明产生了细胞ROS产物。乐鱼平台入口用最高浓度的槲皮素(500 μM)处理的细胞在同样的光激活作用下几乎没有变化，这表明，当槲皮素中和细胞功能之前产生的ROS产物时，这种外流受到干扰。乐鱼平台入口

图4．槲皮素处理HepG2细胞的AOP1荧光动力学曲线为槲皮素浓度(1.95 ~ 500 μM)。每个闪光代表500毫秒的照明，使用安捷伦BioTek Cytation 5细胞成像多模读取器成像灯，强度为1，带有GFP滤波器。2022世界杯附加赛决赛每个数据点代表三次重复的平均值和标准差。

可以对这些数据进行规范化处理，以便实验之间进行比较，如图5所示。原始荧光值在不同的实验之间可能有显著差异。TO浓度、不同细胞数量和不同细胞类型的细微差异会导致原始荧光信号的变变性。对动力学运行的每次荧光测定都归一化为未处理对照的最后一次动力学测定的平均值(可能是最高的原始信号)，并以百分比表示。然后，该分析可用于比较实验对照和实验样品之间ROS活性抑制的时间或程度。

图5。数据归一化后得到AOP1荧光动力学剖面。每个时间点的数据归一化为未处理的对照井在最后一个动态数据点的平均值，并以百分比表示。归一化数据被绘制成时间的函数。每个数据点代表三次重复的平均值和标准差。

归一化数据可在测量后进一步分析。利用曲线下面积(AUC)或数据的积分，可以为每个处理浓度计算CAI。这些数据可用于EC的测定₅₀四参数逻辑拟合模型的值。图6演示了两个独立的EC₅₀槲皮素的测定。

图6。s型拟合得到槲皮素CAI的剂量响应曲线。用AUCs形式的信号积分来计算每个测试浓度对应的CAI。数据表示三次重复的平均值和标准差。

槲皮素EC₅₀分别在15.70和15.78 μM下，R2分别为0.996和0.994，表明该方法具有重复性。这些结果与之前发表的数据一致(槲皮素EC₅₀= 23.66 μm, r²= 0.985)使用专用闪光涂抹器获得。⁴然而，在后一种测试配置中，对于18种光应用中的每一种，microplate都需要从读版器中取出并手动移动到光应用器上。

AOP1检测需要高强度的光来激活检测荧光。以前，这是通过使用荧光阅读器外部的光源来完成的。然而，Cytation 5可以实现显微镜荧光成像和常规荧光检测。显微成像模块提供了聚焦的、波长特定的高能光来激发荧光分子，这可以用作该技术所需的外部光源的替代品。⁸

AOP1抗氧化试验是一种真正独特的活细胞抗氧化试验。它采用荧光技术的基础上控制胞质生产¹O₂而自由基通过光诱导过程可以区分抗氧化作用和细胞毒性作用。与其他抗氧化测定方法不同，荧光传感器虽然与氧化状态严格相关，但与氧化过程无关，不受传感器泄漏的影响。AOP1分析使用归一化动力学测量，使其独立于细胞数量。因为这种活细胞技术是在产生非破坏性自由基水平后测量信号的，所以它可以与其他检测方法进行复用。该检测技术在96孔和384孔微板上的粘附细胞和悬浮细胞都能很好地工作，使其适应高温超导运动。

结论

通过使用成像灯作为内部光感应光源，安捷伦BioTek Cytation 5细胞成像多模式阅读器成为第一个能够在自动“即插即放”配置中完全集成AOP2022世界杯附加赛决赛1检测的微板阅读器。这允许一个简单和健壮的分析协议，与HTS机器人环境兼容。

参考文献

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