2018年12月6日
作者: Peter J. Brescia，应用科学家，BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT美国
摘要
核酸定量仍然是生物科学广泛范围内无数工作流程的中心组成部分。许多这样的工作流程需要从非常小的样品体积中准确地测定样品浓度。强化试剂的使用为在保存珍贵样品的同时进行此类分析提供了一种手段。
介绍
双链脱氧核糖核酸(dsDNA)的定量分析方法多种多样。所选择的方法通常取决于所分析样品的性质和浓度。利用dsDNA在紫外线波长范围内吸收光的本地测量，由于简单，通常是首选。然而，有限的样品量或含有污染物种的样本可能需要更有选择性和更灵敏的检测方法。通常使用与目标分析物螯合的荧光结合染料，产生与分析物浓度成正比的信号，具有高特异性。这允许在复杂的混合物中定量分析感兴趣的分析物，如那些通常在纯化协议或分子遗传学过程的初始步骤中发现的混合物。在这种情况下，由于少量残留污染物的吸收，紫外线吸收决定因素可能导致过高估计样品浓度。当qPCR和哺乳动物细胞转化等下游过程的效率依赖于一个可靠的已知核酸起始浓度时，这就变得越来越关键。
材料与方法
Microplate-based化验
鲱鱼精子DNA，编号D6898，购自西格玛-奥尔德里奇。量子比特®dsDNA BR检测试剂盒，cat #Q32850购自thermofish。96孔实心黑色微板(3915号)来自康宁。以TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5)为稀释剂，将鲱鱼精子DNA稀释至20 μg/mL。用260 nm的吸光度确定最终浓度。使用TE和10 μL等分液移至微孔中，对纯化鲱鱼精进行0.0 ~ 100 ng/μL的一系列稀释。工作量子位试剂是根据制造商的建议，用量子位dsDNA BR Buffer将浓缩量子位原液1:200稀释而成。每孔加入Qubit®工作定量试剂(190 μL)混合，室温避光孵育2分钟。
仪表
荧光测定用a协同™LX多模的读者。使用机载软件和触摸屏界面选择合适的过滤器立方体，定义震动参数，添加延迟，选择井位和协议参数。所有的测量都使用GFP滤片立方体(EX 485/20 nm, EM 528/20 nm和510 nm截止二色镜)。微板测量的增益值设置为100，选择扩展动态范围。此外，该仪器可以在Gen5™软件中进行控制和分析。
结果与讨论
许多涉及dsDNA的工作流程需要在常规程序中保存样品，例如下游工艺的量化。已经开发了荧光互染染料等试剂，用于从极少量的不可回收样品中增强信号。荧光增强试剂可以定量核酸，每微升浓度可达亚皮克图。Qubit®dsDNA BR检测试剂盒含有高选择性增强试剂，专门用于在标准96孔微板格式中使用低至1 μL的容量定量dsDNA。该方法是一种均匀、混合和阅读的方法，其中荧光与分析物成正比。在进行测定时使用dsDNA标准品的连续稀释提供了一种从标准曲线推断样品浓度的方法。在很宽的浓度范围内都可以看到良好的线性关系(图1)。通过调整试剂体积到最终200 μL的测定量，样品体积可以从1 - 20 μL不等。
图1所示。基于微板的分析。双链DNA标准品在体积为200 μL的黑色实心平板上进行三次重复分析。DNA浓度是最终测定量中的DNA浓度。
结论
使用强化试剂分析生物分子增加了可以精确定量的浓度的动态范围。此外，许多这些试剂增加了所需目标分子的特异性，如果上游过程中残留少量杂质，则可以精确定量。当在基于微板的分析格式中使用时，结合小的样品容量，可以实现提高吞吐量，定量到低纳克/微升范围，典型的在各种实验工作流程中的许多中游产量。
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