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蛋白质定量使用纳米橙荧光

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2017年1月26日

使用安捷伦BioTe2022世界杯附加赛决赛k Synergy Neo2混合多模式阅读器定量总蛋白

作者: Paul Held博士安捷伦科技有限公司

摘要

总蛋白质含量是基础科学和临床研究中常见的一种测量方法。虽然几种比色技术是可用的，但它们受到依赖于方法的一些限制。荧光技术已成为可行的，消除了许多与传统方法有关的问题，以测量总蛋白质含量。本应用笔记描述了使用Agilent BioTek的Synergy Neo2混合多模式阅读器定量总蛋白的荧光方法。2022世界杯附加赛决赛

简介

在基础科学和临床研究中，总蛋白质含量的定量是一种常见的测量方法。大多数涉及生物活性测量的生物化学研究都需要将该活性归一化以适应蛋白质含量。当提纯蛋白质或比较不同样品时，特定酶活性的特定活性尤为重要。无论蛋白质测定方法如何，需要高通量的实验室经常采用所描述的方案，以96孔微孔板为基础。在这里，我们描述了一种荧光方法，以96孔微孔板为基础，使用BioTek的Synergy Neo2 Multi-Mode Reader定量总蛋白。

已经开发了几种定量蛋白质的方法。最常用的测定总蛋白含量的方法是在显色试剂的存在下还原铜[1,2]．这些方法效果很好，但会受到蛋白质纯化中常用的许多化合物的干扰，即洗涤剂和还原剂。由于这些方法依赖于易氧化氨基酸的存在，如酪氨酸、半胱氨酸和色氨酸，因此不同氨基酸含量的蛋白质的反应也有很大差异。蛋白质溶液在280 nm处的简单吸光度测量(A280)也会受到蛋白质之间的变化，以及任何污染核酸的干扰。由于这些困难，已经开发了几种染料结合蛋白测定方法;最常用的是布拉德福德所描述的方法[3]．该方法依赖于考马斯亮蓝G-250在与蛋白质结合后转化为蓝色形式，容易形成聚集物，导致信号随着时间的推移而丢失。然而，化合物NanoOrange®与蛋白质的结合，导致荧光部分的形成，不会随着时间的推移导致聚集或信号丢失。

材料与方法

NanoOrange®蛋白质定量试剂盒，目录号N-6666，从赛默飞世尔购买。96孔黑色微孔板，底部透明，目录号3915，购自康宁公司(Corning, NY)。

以1x NanoOrange®工作溶液为稀释剂，将牛血清白蛋白(BSA)从0.0到10 μg/ mL进行一系列稀释。根据NanoOrange®试剂盒说明书[4]，将浓缩缓冲原液与蒸馏水1:10稀释，制备工作溶液。该缓冲液随后用于稀释纳米橙®染料浓缩液1:1000，以制成1x工作溶液。蛋白质样品稀释后，在95ºC下孵育10分钟，然后冷却至室温。将冷却后的样品等分(200 μL)移液至微孔中，每重复8次。荧光测定使用BioTek仪器的Synergy Neo2多模式阅读器，使用单色仪或过滤器立方体。单色仪的激发波长为485 nm，带宽为30 nm，发射波长为590 nm，带宽为30 nm。荧光滤光立方体使用485/20激发和590/30发射滤波器与510 nm截止二向色镜结合。

结果与讨论

测定BSA蛋白浓度范围为0.0 ~ 10µg/mL的荧光强度，如图1所示。在这个范围内，荧光强度以双曲线的方式增加。使用安捷伦BioTe2022世界杯附加赛决赛k Gen5微板读取器和成像仪软件，可以生成描述曲线的4参数非线性方程。较低的浓度表现出线性响应。当检查反应的线性性时，最小均方直线可用于DNA浓度高达1,000 ng/mL，具有非常高的置信度。

基于滤波器的检测的线性。

图1所示。基于滤波器的检测的线性。4参数回归分析BSA在0.0 ~ 10 μg/mL浓度曲线。插入图用线性回归分析描述了较低蛋白质浓度(0至1000 ng/mL)的数据点。数据点表示每种浓度下8种测定值的平均值。

标准的平均方差系数为7.5%，其中最大的变化主要发生在测试的最低蛋白质浓度(数据未显示)。虽然曲线是非线性的，但使用数据的4参数逻辑拟合，可以以较高的置信度(r2 = 0.995)作出确定。在灵敏度方面，发现该反应对纳克水平敏感，25 ng/mL的荧光强度值与空白有统计学差异(P<0.002)。线性回归的决定系数(r2=0.997)表明，在这些极低的浓度下，可以以较高的置信度进行浓度测定。

除了用于荧光检测的过滤器立方体外，Synergy Neo2还可以配置用于激发和发射的双单色仪。与基于滤波器的检测相比，使用单色器进行波长选择可以观察到类似的线性(图2)。

单色仪检测的线性。

图2。单色仪检测的线性。4参数回归分析BSA在0.0 ~ 10 μg/mL浓度曲线。插入图用线性回归分析描述了较低浓度(0至1000 ng/mL)的数据点。数据点表示每种浓度下8种测定值的平均值。

尽管在原始尺度上的幅度较低，但与滤波器相比，单色器提供了更好的信号与背景比，如图3所示。这主要是由双单色仪产生的低背景测量结果。无论使用哪种光学系统，都可以观察到20倍或更大的检测窗口。

单色仪和滤波器检测的信号/背景比较

图3。单色仪和滤波器检测的信号/背景比较。绘制各样品与空白平均值(0 μg/mL BSA)的比值。数据表示八个测定值的平均值和标准差。

这种荧光总蛋白检测与BioTek的Synergy Neo2 Multi-Mode Reader结合使用具有几个优点。由于工作溶液中的SDS去污剂在加热后保持了蛋白质的变性状态，因此如果避免光照，可以在数小时后读取样品而不损失灵敏度。像大多数在微孔板中读取的分析一样，快速读取所有样品的能力大大减少了获取数据所需的人工劳动。微孔板格式也适合于高容量要求的实验室的“现成”自动化。微孔板中较小的反应体积将减少所需昂贵试剂的数量，从而降低每次检测的成本。

参考文献

  1. 劳瑞，o.h.等人(1951)。生物化学193:265-275。
  2. 史密斯，p.k.，等等…(1985)。分析生物化学150:76-85。
  3. 布拉德福德，M.M.(1976)。分析生物化学72:248-254。
  4. 纳米橙蛋白定量试剂盒

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