用数字广角显微镜测定组蛋白甲基化酶和去甲基化酶抑制剂的表型和表观遗传作用机制

作者: Brad Larson和Peter Banks，应用部门，BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT

简介

组蛋白赖氨酸甲基化是一个可逆的过程，受赖氨酸甲基转移酶和去甲基化酶的动态调控。一般来说，组蛋白H3赖氨酸4 (H3K4me)、H3K36或H3K79的甲基化与活性转录相关，而H3K9、H3K27或H4K20的甲基化与基因沉默相关。

EZH2是一种高度保守的组蛋白甲基转移酶，专门靶向H3K27并作为转录抑制因子发挥作用¹．乳腺癌的组织微阵列分析发现EZH2的持续过表达与肿瘤侵袭性密切相关。化合物DZNep已被证明可以抑制EZH2，减少H3K27的甲基化，并选择性地诱导包括MCF-7在内的癌症细胞系的凋亡²．

组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1 (LSD1)是第一个被发现的能够特异性去甲基化组蛋白H3 (H3K4me1和H3K4me2)的单甲基化和二甲基化赖氨酸4的组蛋白赖氨酸去甲基化酶。LSD1在er阴性乳腺肿瘤中高度表达，因此LSD1被认为是乳腺侵袭性肿瘤生物学的预测标记物，是治疗er阴性乳腺癌的一个新的有吸引力的治疗靶点。LSD抑制剂II已被证明可以抑制LSD1，促进H3K4的二甲基化，从而缓解基因沉默，并促进癌细胞的毒性^3.．

组蛋白修饰酶(如LSD1和EZH2)活性的增强导致关键基因(如肿瘤抑制基因)的表观遗传沉默，这些基因已被证明在乳腺肿瘤的发生中发挥重要作用。一系列新的化合物作为组蛋白甲基化或去甲基化的强大抑制剂，能够诱导异常沉默的基因在乳腺肿瘤发生中重要的重新表达。

在这里，我们展示了监测组蛋白甲基化酶和去甲基化酶抑制剂的效果的能力，选择性地诱导癌细胞系的凋亡。将稳定表达GFP的MCF-7乳腺癌细胞和稳定表达RFP的人新生儿真皮成纤维细胞合并，以创建一个更像活体的细胞模型。使用荧光探针监测细胞凋亡的诱导，而光蛋白允许在共培养中区分最终对两种细胞类型的细胞毒性作用。然后使用针对特定组蛋白H3赖氨酸残基及其甲基化状态的抗体对抑制剂的作用机制进行研究。所有的评估都是通过使用一种新型细胞成像多模式阅读器的数字显微镜进行的。

材料与方法

材料

细胞

MCF-7 GFP细胞(目录号;AKR-211)从Cell Biolabs, Inc. (San Diego, CA)购买。MCF-7细胞(目录号;HTB-22)从ATCC(马纳萨斯，弗吉尼亚州)购买。人新生儿皮肤成纤维细胞(目录编号;cAP- 0008RFP)购自Angio-Proteomie (Boston, MA)。MCF-7细胞分别在来自Life Technologies (Carlsbad, CA)的MEM α培养基(目录编号12561-049)+胎牛血清、10%(目录编号10437- 028)、penp - strep、1x(目录编号15070- 063)和人重组胰岛素(目录编号12585- 014)中繁殖。成纤维细胞在高级DMEM培养基(目录编号12491-015)+胎牛血清(FBS)， 10%(目录编号10437-028)和1倍(目录编号10378-016)中繁殖，同样来自Life Technologies。

实验组件

盐酸DZNep(目录号;SML0305)从Sigma Aldrich(圣路易斯，密苏里州)购买。柴叶霉素(目录号382191)和LSD1抑制剂II(目录号489477)购于EMD Millipore (Billerica, MA)。兔抗h3k9me3多克隆(目录号;ab8898)，抗H3K27me3小鼠单克隆抗体(目录编号:ab8898;ab6002)，山羊抗h3k4me2多克隆(目录编号;ab11946)， Alexa Fluor®555标记的驴抗兔多克隆(目录编号:ab150074)， Alexa Fluor®594标记的驴抗山羊多克隆(目录编号:ab150132)从abcam (Cambridge, MA)购买。Alexa Fluor®488标记的山羊抗鼠多克隆(目录号; A-11017) was purchased from Life Technologies. Annexin V-iFluor™ 350 Conjugate (Catalog No. 20070) and 7-Aminoactinomycin D (Catalog No. 17501) were donated by AAT Bioquest (Sunnyvale, CA).

细胞增殖5细胞成像多模式阅读器

Cytation™5是一种模块化的多模式微板阅读器，结合了自动数字显微镜和微板检测。细胞增殖5包括过滤和单色仪微板读数;显微镜模块提供高达60倍放大的荧光，亮场，彩色亮场和相位对比。对于活细胞分析，cyation 5的特点是温度控制到65°C, CO₂/ O₂用于动力学分析的气体控制和双注射器。颤抖和Gen5™软件也是标准的。该仪器用于表达荧光蛋白的细胞成像，除了荧光探针和标记2^o复合潜伏期后的抗体。

Gen5数据分析软件

Gen5™软件控制cyation 5的操作，用于自动数字显微镜和基于ppm的微板读取。图像采集从样本平移、聚焦到曝光控制都是完全自动化的。细胞分析允许定量表型和表观遗传效应后的复合处理。

细胞毒性检测

Annexin V-iFluor™350 Conjugate

膜联蛋白是一类在钙存在时与磷脂膜结合的蛋白质。在细胞凋亡中，磷脂酰丝氨酸(PS)转移到质膜的外叶。细胞表面PS的出现是细胞凋亡初期/中期的通用指标，可以在观察到形态学变化之前检测到。因此，Annexins是检测细胞表面表达PS的凋亡细胞的有价值的探针。350 Conjugate的347 nm和443 nm的激发和发射最大值与Cytation 5的DAPI成像滤波器立方体兼容。

7-Aminoactinomycin D

7-氨基放线菌素D (7-AAD)是一种非专用染料，用于识别非活细胞。细胞膜受损或细胞代谢受损或没有代谢的细胞无法阻止染料进入细胞。一旦进入细胞，染料与细胞内DNA结合，产生高荧光加合物，从而识别出细胞是不可存活的。探针的546 nm和647 nm的激发和发射极值与Cytation 5的Texas Red成像滤波器立方体兼容。每个探针允许与表达红色和绿色荧光蛋白的细胞进行多路复用。

方法

细胞制备和电镀

抑制剂细胞毒性评估

为了进行细胞毒性/细胞数量的测量，将表达GFP的MCF-7乳腺癌细胞和表达RFP的原代人真皮成纤维细胞以100 μL的体积加入到8列96孔黑色透明底胶原蛋白涂层板(康宁生命科学目录号356649)中，使最终浓度为1.0 × 10⁴每种细胞类型的细胞/孔。除了MCF-7 GFP细胞仅被添加到平板上外，凋亡/坏死评估也采用了相同的程序。

行动决定的表观遗传机制

除了在实验中单独使用不表达gfp的MCF-7细胞外，我们采用了与之前列出的相同的步骤。

化合物剂量

经过一夜37度的潜伏期^oC / C的5%_O2，从所有井中移除介质。然后将含有DZNep (H3K27甲基化抑制剂)、chae菌素(H3K9甲基化抑制剂)或赖氨酸特异性去甲基化酶(LSD)抑制剂II(增加H3K4二甲基化)滴定的培养基添加到平板的前两列。在所有剩余的井中单独添加培养基。每天重复这一过程，每天将抑制剂添加到另外两个柱中，形成24、48、72和96小时的细胞孵育时间。

基于图像的细胞分化分析

抑制剂细胞毒性评估

孵育期结束后，移除含有化合物的培养基，用含有Hoechst 33342的培养基进行细胞毒性/细胞数量测量，或使用Annexin V-iFluor™350 Conjugate和7-AAD荧光探针进行凋亡/坏死评估。然后使用Cytation 5成像，使用4倍或20倍物镜，然后使用Gen5™数据分析软件进行细胞分析。

行动决定的表观遗传学机制

在96小时的加药期之后，再次除去化合物和培养基。然后将细胞固定，渗透，用1^o和2^oAb，除了被分析的表观遗传抑制剂特异性荧光探针外:

DZNep -组蛋白H3K27me3 1°Ab;Alexa 488 2°Ab;赫斯特33342;德州红Phalloidin
柴菌素-组蛋白H3K9me3 1°Ab;Alexa 555 2°Ab;赫斯特33342;Alexa 488 Phalloidin
LSD异烟肼。II -组蛋白H3K4me2 1°Ab;Alexa 594 2°Ab;赫斯特33342;Alexa 488 Phalloidin

再次使用Cytation 5进行成像，使用4x和20x物镜，然后进行细胞分析。

结果与讨论

表型细胞毒性评估

通过潜在的新的抗癌疗法在目标细胞类型中诱导最终毒性作用的能力是至关重要的。然而，合并适当的单元模型也很重要。肿瘤由多种细胞组成，包括癌细胞和基质细胞。因此，包含人真皮成纤维细胞可以为测试创造一个更合适的微环境。利用表达荧光蛋白的细胞来鉴定分子对每种特定细胞类型的影响已变得越来越流行。DZNep，催产素和LSD Inh。II，已知都能改变组蛋白赖氨酸甲基化状态，通过测试来确定在总给药期间共培养的细胞类型中是否诱导细胞毒性。

图1所示。每种细胞类型的细胞毒性效应。(A)用DZNep、叶催产素或LSD Inh孵育24、48、72和96小时后，荧光叠加20x图像。2蓝色:Hoechst 33342染色核;绿色:表达GFP的MCF-7细胞;红色:表达RFP的成纤维细胞。使用从(B) DZNep处理的井中捕获的4x图像计算相对总细胞和单个细胞类型计数;(C) chaetocin;(D) LSD Inhl II。%未处理井细胞计数确定为每个时间点使用以下公式:细胞计数_善待/细胞计数_{未经处理的很好}* 100。

通过使用单个通道捕获每个荧光蛋白发出的信号，荧光成像提供了辨别特定细胞类型的细胞毒性作用的能力。DZNep降低GFP的表达(图1A)，并选择性地减少MCF-7细胞数量(图1B)，这与之前发表的结果一致²．叶催产素在抑制H3K9组蛋白甲基转移酶活性的同时，也是细胞ROS的有效诱导剂⁴，它对多种细胞类型有更广泛的影响(图1A和C)。II已知抑制er阴性乳腺肿瘤中高表达的LSD1的基因沉默效应，但对细胞数量的影响很小(图1A和D)。这可能表明，虽然可能发生了表观遗传修饰，但该化合物的下游细胞毒性作用需要延长给药时间。

图2。凋亡和坏死活性测定。(A)用DZNep或柴叶催产素孵育24、48、72和96小时后，荧光叠加20x图像。蓝色:Annexin V-iFluor 350凋亡检测信号;红色:7-AAD坏死检测信号;绿色:表达GFP的MCF-7细胞。使用(B) DZNep处理孔捕获的4x图像计算相对凋亡和坏死细胞计数;(C) chaetocin;或(D) LSD Inhl II，使用图1中解释的公式。

也可以通过添加荧光探针来测定导致细胞毒性的凋亡和坏死活性(图2)。叶催产素以时间和剂量依赖的方式诱导MCF-7细胞内的凋亡和坏死(图2A和C)。DZNep对细胞的影响更受控制，激活凋亡通路，但在给药期间显示很少或没有坏死活性(图2A和B)。II显示没有凋亡或坏死活性诱导的证据，证实了从细胞毒性评估中看到的结果(图2D)。

一旦对测试分子处理的最终表型结果做出最终结论，就可以进行作用机制研究，以确认与产生下游效应相结合的表观遗传修饰。

行动决定的表观遗传机制

表型分析与作用机制的结合越来越多地适应于药物发现领域，并提供了包括表观遗传抑制剂在内的测试分子作用的更完整的图像。结合针对特定组蛋白赖氨酸氨基酸甲基化状态的一抗，结合荧光标记的二抗体，提供了一种敏感和特异性的方法来检测潜在的表观遗传修饰。事实上，这些修饰发生在靶细胞的细胞核内，也允许加入核染料，并通过Gen5数据分析软件进行亚群体分析。

图3。抑制剂诱导的表观遗传修饰分析。荧光叠加20x图像后指定的孵育与表观遗传抑制剂。(A)蓝色:Hoechst 33342染色核;红色:德州红phalloidin actin染色;绿色:组蛋白H3K27me3^oAb + Alexa 488 2^oAb. (B)蓝:Hoechst 33342染色核;绿色:Alexa 488 phalloidin肌动蛋白染色;红色:Histone H3K9me3^oAb + Alexa 555 2^oAb. (C)蓝:Hoechst 33342染色核;绿色:Alexa 488 phalloidin肌动蛋白染色;红色:Histone H3K4me2^oAb + Alexa 594 2^oAb.总细胞计数和Ab结合细胞计数使用捕获的10x图像处理井(D) DZnep;(E) chaetocin;或(F) LSD Inh。2细胞比率由Ab结合细胞数除以每个孔的总细胞值确定。

DZNep抑制EZH2活性，降低H3K27的甲基化。由于添加到这些孔中的一抗与三甲基化的H3K27结合，随着化合物孵育时间的增加，荧光标记的二抗发出的荧光水平以剂量依赖性的方式降低(图3A和D)。因此，在这个分子中可以看到类似的现象。然而，如前所述，叶催产素对MCF-7细胞也有更强的细胞毒性作用，在表观遗传效应出现后不久，导致细胞数量急剧减少(图3B和E)。最后，LSD抑制剂II降低LSD1的去甲基化活性，使H3K4的甲基化增加。H3K4me2一抗结合的增加是化合物孵育增加的结果(图3C和F)，这可能导致先前在文献中看到的毒性表型效应。

上述结果验证了测试化合物所显示的作用机制，也证实了Cytation 5检测治疗和未治疗癌细胞模型表观遗传状态的修饰的能力。

结论

结合表达荧光蛋白(FP)的细胞系，可以通过Cytation 5的广角显微镜功能，简化、快速检测共培养细胞模型的细胞毒性效应。活细胞检测也可以与FP表达的细胞进行复用，以进一步了解测试分子的表型效应，使用Cytation 5的多个、单独的成像通道。使用Gen5数据分析软件自动准确地进行细胞分析，以确定指定潜伏期后的活细胞、凋亡细胞和坏死细胞数量。利用基于抗体的检测和Gen5的亚群体能力，也可以评估目标组蛋白赖氨酸残基甲基化状态的修饰。细胞模型、灵敏的活细胞或固定细胞检测和基于图像的细胞分析相结合，为更好地理解潜在的新型抗癌疗法的表型效应和表观遗传作用机制提供了理想的途径。

参考文献

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3. Konovalov, S.， Garcia-Bassets, I.人类卵巢肿瘤中赖氨酸特异性去甲基化酶1 (LSD1) mRNA水平的分析以及化学LSD1抑制剂对卵巢癌细胞系的影响。中华医学杂志，2013,6,1-15。
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