2016年6月29日
作者:安捷伦科技公司Leonie Rieger和Brad Larson;Ulf拉德勒,ibidi GmbH是一家
简介
细胞迁移是细胞的随机运动，在生理和病理过程中起着重要作用。细胞迁移是基本生物过程的组成部分，如组织形成、伤口愈合和免疫反应，以及癌症侵袭和转移等过程。1、2细胞移动的基本原理是一个循环的5步过程，从细胞极化和前缘突出开始。第二步，前缘附着在底物上，随后进行物理屏障的蛋白水解降解，如组织成分和肌动球蛋白收缩。最后，细胞后部向前滑动。集体细胞运动的主要修正是前缘的剩余细胞间细胞间连接。因此，主要步骤是同时协调的。2先进的知识和对集体细胞迁移机制的理解对于开发新的治疗策略来控制至关重要，例如，细胞侵袭是癌症转移的关键作用。
研究细胞迁移的有力工具是伤口愈合试验。在形成融合细胞单层的人工缝隙(以划痕的形式或通过去除生长障碍的形式)后，随着时间的推移，检测跟踪细胞从边缘迁移，直到建立新的细胞-细胞接触，缝隙再次闭合。伤口愈合程度和伤口愈合率提供了关于迁移特性、细胞健康和与其他细胞相互作用能力的信息，以及测试分子如何影响这些参数。
在这个应用笔记中，我们进行了各种细胞类型移动到创造的间隙或愈合伤口的能力的实验。此外，细胞松弛素D对伤口愈合的抑制作用也显示出来。采用ibidi提供的培养基插入片和35 mm的培养皿进行创面愈合实验。使用Agilent BioTek Lionheart FX自动显微镜监测伤2022世界杯附加赛决赛口闭合情况，并使用Agilent BioTek Gen5微板阅读器和成像软件自动对捕获的动态图像进行细胞分析。
材料与方法
材料
ibidi Culture-Insert:ibidi培养插入剂主要用于取代经典的划痕检测。放置在细胞培养表面的硅插入物提供了两个细胞培养池。这两个腔室用500 μ m厚的壁分开。由于特殊设计的表面，培养插入物粘在一个µ-Dish或24孔板的底部。由于粘性设计，细胞不能在壁下生长。在实验中，培养皿中的培养-插入2孔35毫米，高(零件号81176)由ibidi GmbH(慕尼黑，德国)使用和提供。
细胞:HT-1080纤维肉瘤细胞(零件号CCL-121)和永生化角质形成细胞(零件号CRL - 2309)购自ATCC (Manassas, VA)。表达人新生儿皮肤成纤维细胞的RFP(部分号cAP - 0008RFP)从Angio-Proteomie (Boston, MA)获得。
伤口愈合抑制剂:化合物Cytochalasin D(零件号1233,R&D Systems;明尼阿波利斯，MN)被用于抑制细胞迁移，因为它干扰肌动蛋白聚合和有力地破坏肌动蛋白丝功能。3.
2022世界杯附加赛决赛Agilent BioTek Lionheart FX自动显微镜:
带有增强显微镜的Lionheart FX自动显微镜提供了高倍率图像的数字显微镜，使用高达100倍的物镜。此外，显微镜模块提供荧光显微镜，亮场，彩色亮场和相位对比。由于环境控制，包括温度、气体控制和湿度室，该系统优化了长期动力学分析和活细胞成像。该仪器用于在相位对比中监测伤口闭合情况。
2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen5微生物板阅读器和成像软件:
在自动图像捕获和分析中，使用了Gen5 3.0微版阅读器和成像仪软件。从样本翻译、聚焦和曝光控制，图像采集是完全自动化的。包含的单元格分析工具计算变量参数的精确值，例如，对象的面积和大小，以及对象的强度。使用定制的转换工具，可以将计算值转换为首选的表示方法。
MetaVi Labs小区分析软件:为了验证Gen5提供和计算的数据，使用了第二个独立的分析工具。在整个潜伏期捕获的图像被上传到他们的网站。软件还需要像素分辨率值进行计算。在对图像进行分析后，软件提供了一份详细的报告，其中包括显示不同伤口愈合决定的图表。
方法
细胞的准备: HT-1080纤维肉瘤细胞、永生化角化细胞和新生儿真皮成纤维细胞在T75-Flask中培养至融合度达80%。用酶将细胞从烧瓶中分离出来。每种细胞重悬至浓度5.0 × 105细胞/mL和70 μ L的细胞悬浮液(每个储液库35,000个细胞)被添加到插入物的每个腔室(图1)。细胞被允许附着在涂有涂层的培养皿底部，并在一夜之间达到融合。用无菌镊子取出塑料插入物。用2ml新鲜培养基洗涤细胞贴片后，用2ml含10000 nM、100 nM、0 nM Cytochalasin D的培养基替换。
图1所示。在伊比迪培养基中进行伤口愈合测定的实验流程。步骤3中使用的培养基含有10000 nM、100 nM或0 nM的细胞松弛素D。
成像:盘子被放置在µ-Dish显微镜架(ibidi，零件号80035)和固定与磁性盖子额外稳定。支架放置在Agilent BioTek Lionhea2022世界杯附加赛决赛rt FX中，之前设置为37°C和5% CO2．在20小时内，使用相位对比和4倍物镜每30分钟对伤口区域进行一次成像。
基于图像的细胞运动分析:对在整个潜伏期捕获的所有4x相位对比图像进行细胞分析。使用表1中的元胞分析参数，Gen5自动在满足指定标准的对象周围放置掩码。
表1。2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen5细胞分析参数的物体掩膜放置。符合指定标准的物体将用黄线标记。
除了细胞分析参数外，还使用了先进的检测选项。评价背景降低到1%，以便准确识别图像插件中包含单元格的区域和空区域。背景平坦化是为了增强目标与背景之间的对比度，减少迁移细胞区域内信号的细微变化。最后，利用图像平滑进一步平滑细胞区域内相位对比信号的变化，以准确地掩盖集体细胞单层。我们没有对整个视野进行分析，而是将宽度为700 μ m、长度为1457 μ m的图像塞应用于整个4倍图像(图2)。我们选择了一个宽度为700 μ m的图像塞，不仅包括完整的伤口区域，还包括两侧的小细胞区域，用于细胞分析和比较相位对比。1457 μ m的栓子长度等于该维度的4倍视野。
图2。用于确定伤口愈合结果的指标。塞的宽度为700 μ m，长度为1457 μ m。画了两条代表性的线来显示在整个伤口长度上的可变伤口宽度。黄线显示Agilent BioTek Gen5使用表1中定义的参数屏蔽放置的对象。2022世界杯附加赛决赛
伤口愈合指标的计算:表1中列出的细胞分析参数用于定义一个初级掩码，该掩码量化了图像插头中包含细胞的区域。这个掩码如图2所示。从掩膜中获得的(Sum Area)t的计算度量可用于量化细胞迁移进程作为动力学分析中时间的函数，使用下面概述的一系列数据简化步骤。
平均缠绕宽度随时间的变化:虽然培养插入提供了一种简单的方法来创建无细胞间隙，但其宽度在实验内部和实验间的可变性仍然存在。通过计算每个时间点的平均伤口宽度，这可以很容易地用于Gen5图像分析。
虽然培养插入提供了一个简单的方法来创建一个细胞游离间隙，但其宽度在实验内部和实验间的可变性仍然存在。通过计算每个时间点的平均伤口宽度，这可以很容易地用于Gen5图像分析。
公式1。平均伤口宽度作为时间的函数。
其中Wt是平均缠绕宽度(μm)作为时间的函数;P一个图像插塞面积(μm ?2）;Pl为图像插拔长度(μm)， (Sum Area)t为计算公制表Gen5 (μm2）.
伤口愈合率:第一个动力学时间点的平均伤口宽度也被用来计算伤口区域内的汇合率，根据以下公式。
公式2．伤口区域内的吻合
其中Wt = 0为第一个时间点的平均缠绕宽度(μm);PW为图像塞宽(μm);Pl为图像插拔长度(μm)， (Sum Area)t为计算公制表Gen5 (μm2）.
固定伤口宽度间隙的通度百分比:此外，根据下式计算HT-1080细胞系在固定创面面积(500 μm)内的愈合率和最大创面愈合率。
公式3。固定伤口间隙的一致性
其中Wl是固定的伤口长度和WW是固定的伤口宽度;PW为图像塞宽(μm);Pl为图像插拔长度(μm)， (Sum Area)t为计算公制表Gen5 (μm2）.
最后，Gen5 3.0的动力学分析工具计算出实际创面面积曲线的最高斜率，得到最大创面愈合率(μm²/ min)。
结果与讨论
无标签监测伤口愈合随时间的变化及其细胞松弛素D的抑制作用
图3 - 5展示了Lionheart FX精确成像三种不同细胞类型的间隙闭合过程的能力。细胞类型分别用10000 nM、100 nM或0 nM(对照)细胞松弛素D处理，每隔30分钟进行20小时的成像。
HT-1080细胞表现出集体表型运动，导致间隔在8小时后闭合(图3A)。虽然100 nM的Cytochalasin D轻度抑制了伤口愈合(图3B)，但与对照组相比，较高浓度的10000 nM Cytochalasin D完全阻止了细胞迁移(图3C)。
图3。基于图像的HT-1080迁移监测。使用相位对比和4倍放大成像超过20小时。(A) 0， (B) 100，或(C) 10,000 nM细胞松弛素D处理的细胞动力学图像。
相比之下，角质形成细胞开始作为单细胞迁移，并在9.5小时后结束闭合伤口(图4A)。与对照组相比，较低浓度的Cytochalasin D对总间隙闭合有影响，即使在20小时后，人工创造的伤口也没有闭合(图4B)。与对照组相比，经过10000 nM化合物处理的角质形成细胞没有移动，因此没有迁移(图4C)。
图4。视觉证实角质形成细胞伤口愈合。使用相位对比和4倍放大成像超过20小时。动力学图像显示的细胞处理(A) 0;(B) 100;或(C) 10000 nM细胞松弛素D。
最后，也可以监测较大的丝状成纤维细胞在间隙中移动(图5A)。在20小时的潜伏期内，成纤维细胞不能在伤口区域内汇合。与对照组相比，在培养基中加入100 nM的Cytochalasin D会减缓伤口愈合(图5B)。在所有测试的细胞模型中，最高浓度的Cytochalasin D具有最大的观察效果。如图5C所示，不仅细胞迁移，而且细胞粘附也受到影响，表明对成纤维细胞有潜在的坏死作用。
图5。基于图像的成纤维细胞迁移监测。使用相位对比和4倍放大成像超过20小时。动力学图像显示的细胞处理(A) 0;(B) 100;或(C) 10000 nM细胞松弛素D。
基于图像的细胞分析对伤口愈合及其抑制作用的量化
如前所述，使用的细胞分析参数(表1)能够精确地量化使用初级掩码(Sum area)的插头图像中细胞所占的区域。t．图6对HT-1080单元模型的三个时间点进行了描述。然后，利用公式1和公式2，可以在Gen5的数据约简工具中确定平均缠绕宽度、Wt和% confluent。
图6．不同时间点的代表性图像显示了Gen5 3.0提供的细胞分析工具所使用的对象掩码。
图7显示了使用三种不同浓度的细胞松弛素D的三种细胞模型在21小时内的动力学图。细胞迁移在三种细胞系之间有所不同，尽管在每种情况下，细胞松弛素D都表现出以剂量依赖的方式抑制细胞迁移的能力，尽管程度不同。HT-1080细胞的游离间隙在7-10小时后闭合，而角质形成细胞的游离间隙在8-10小时后略有延迟。相比之下，成纤维细胞在孵育约10小时后仅达到80%的一致性，在最高的抑制剂浓度下显示了粘附性的丧失，其一致性为负%。
图7。伤口区域融合率的定量显示细胞迁移。用公式2计算数值
为了更好地解释观察到的表型结果，Gen5还提供了使用替代指标监测伤口愈合的用户友好的方法。图8中使用HT-1080细胞模型的结果演示了这些。例如，右上图(图8)所示的固定伤口面积的计算可以帮助解释复制之间的差异。这一点非常重要，特别是当细胞在初始成像发生之前就开始迁移时(图4A和5A)。为了显示实际的伤口闭合情况，绘制伤口平均宽度随时间变化的曲线(图8左下图)提供了细胞移动本身的信息。在没有Cytochalasin D的情况下，HT-1080细胞会一起移动，从而缩小差异值，接近0。相比之下，用最高浓度的抑制剂处理的HT-1080细胞显示出恒定的平均创面宽度。最后，Gen5中包含的动力学分析工具对每条曲线进行评估，以确定最大伤口愈合率。如图8的右下图所示，细胞松弛素D减缓伤口愈合，直到值达到0，测试的最高浓度。总之，这些由Gen5自动确定的指标提供了很高的信息含量，并使人们对伤口愈合以及添加抑制化合物如何改变愈合过程有了更全面的了解。
图8。伤口愈合和细胞迁移的可变决定。用公式1、2、3计算数值。
为了验证Gen5执行的分析，还使用了MetaVi实验室提供的第二个独立软件。两种分析软件的分析结果相似。
图9中显示的“闭合所有位置的百分比差距”的图表与图8中显示的“固定伤口区域的一致性%”的图表相比较。“划痕开放区域所有位置”可以与图8中的“平均伤口宽度”进行比较。虽然曲线形状一致，但值表示不同的指标。伤口面积以μm²计算，而不是以μm计算伤口宽度。这两个指标都显示了随着时间推移的相同进展。最后，该软件还计算了“间隙闭合速度”(图9)，这与Gen5软件对最大伤口愈合率的动力学分析(图8)一致。
图9。使用独立细胞分析软件测定伤口愈合情况。
结论
伤口愈合试验是研究细胞迁移的一种有效方法。伊比迪提供的培养插入和35毫米的µ-Dish简化了性能，并允许容易的化合物添加。结合实验程序所得到的结果与先前文献中所显示的结果一致。安捷伦B2022世界杯附加赛决赛iotek Lionheat FX自动显微镜非常适合进行伤口愈合过程的长期动态成像。安捷伦生2022世界杯附加赛决赛物科技2022世界杯南美区预选赛 细胞成像多模式阅读器也能够执行实验设置所需的成像。适当的细胞健康可以通过加入适当的环境设置在孵化时间。集成增强显微镜结合了精确的延时成像和精确的数据分析。计算每种细胞类型的合流率，同时也可以使用安捷伦Biotek Gen5微板阅读器和成像软件自动计算各种间隙闭合的测定。2022世界杯附加赛决赛使用MetaVi实验室提供的独立第二分析软件对结果进行了验证。简单的实验设置、成像和精确的数据分析的结合创造了一个强大的工具来研究细胞迁移。
参考文献
- https://www.nature.com/subjects/cell-migration
- Ilina Olga和Friedl Peter;细胞迁移机制概述2009;细胞科学杂志:122,3203-3208。
- 约翰H.汉森，罗尼埃尔纳扎里安，卡特里娜L.舒尔伯格，瓦莱丽A.特拉布什，莎拉E.科尔尼克，安德鲁R.伯恩斯和肯尼斯J.麦克帕特兰;单细胞片状足的伤口愈合:肌动球蛋白囊线缺失下肌动蛋白聚合作用的冥想2002;细胞分子生物学:卷13,1001-1014。
确认
作者要感谢Michael Wyler, Joel Mailliet和Gary Prescott对应用说明中所包含的最终分析方法的贡献。