2008年8月21日
作者: Paul Held，博士，安捷伦科技公司;索尔塔尼纳萨布s.r.，索托斯j.p.，邦兹医学博士，威廉姆斯洛杉矶，威廉姆斯j.w.，鸭嘴兽技术有限责任公司;雅培n.l.，墨菲C.J，鸭嘴兽科技有限责任公司和威斯康星大学
摘要
细胞迁移是维持体内平衡的一种基本细胞行为，是转化细胞伤口愈合和转移的必要因素。改进的细胞迁移高通量筛选方法将促进潜在的先导治疗化合物的鉴定。在这里，我们报道了一种利用96孔格式的新型细胞迁移试验的开发和验证。Oris细胞迁移试验集成了一个96孔板，板上的聚合物插入物将细胞排除在孔的中心区域，并在板的底部安装一个掩模，将信号检测限制在每个孔的中心区域。在细胞被播种并附着后，移除聚合物插入物，允许细胞迁移到中央分析区(由不透明掩膜定义)。孵育后，对细胞进行染色，并使用安捷伦BioTek Synergy HT多模式读取器进行测定。2022世界杯附加赛决赛这里描述Oris细胞迁移实验，并提供数据支持其用于筛选可能刺激或抑制细胞迁移的测试化合物。检测格式允许用户将细胞迁移作为一个终点或动力学检测．
简介
细胞迁移是在伤口愈合、新生血管形成和免疫系统工作等过程中发展和维持内稳态所固有的一种基本活动。细胞迁移失败，或侵入性细胞移动到不适当的位置，是许多疾病过程的核心，如伤口愈合失调和癌症。此外，了解细胞迁移对组织工程等新兴技术和假体设备的成功生物整合至关重要。需要新的技术，使迁移和入侵分析更可靠，劳动强度更低，消耗更少的细胞和试剂，可以在更短的时间内执行，并适应高通量格式。在这方面，本文描述了一种新的二维细胞实验，Oris细胞迁移实验，并提供了数据支持其用于筛选可能刺激或抑制细胞迁移的测试化合物。正在申请专利的检测格式允许用户研究细胞迁移作为终点或动力学检测。
Oris细胞迁移试验(图1)是一个多步骤过程，首先在96孔微孔板的孔底应用掩膜。此外，聚合物插入件被安装到微孔板的内部。当细胞被添加到微板的孔中时，该插入物防止细胞在孔内分析区播撒种子。细胞附着后，插入物被移除，允许细胞自由迁移到井的中心分析区。尚未迁移到分析区的细胞被最初应用于板底的遮罩挡住了视线。通过显微镜或使用荧光的Synergy HT多模读取器检测迁移细胞。
图1所示。Oris细胞迁移实验示意图。
Synergy HT是一个多模式阅读器，利用两套独立的光学器件，提供不妥协的性能。对于吸光度测量，有一个带有单色仪的氙气闪光灯，用于波长选择和光电二极管检测。这允许选择任何波长的端点或动力学测量，从200 nm到999 nm在1 nm的增量，以及光谱扫描。传统的可见波长荧光测量是使用钨卤素灯和干涉滤光片(激发和发射)进行波长选择和光电倍增(PMT)检测。
辉光发光测量也很容易在Synergy HT中完成。Synergy HT能够读取高达384孔板的任何板格式，提供高达50°C的温度控制和作为标准功能的震动。
实验
材料与方法
钙黄素AM (C3099)来自Invitrogen公司，细胞追踪器绿色(PA-3011)来自Cambrex BioSciences公司。丝裂霉素C(47589)从Calbiochem中分离得到，Latrunculin A (T119)从BIOMOL中分离得到。FBS来自Atlanta Biological, EGF (E3476)来自Invitrogen。Oris细胞迁移实验来自Platypus Technologies。NIH 3T3成纤维细胞和HT1080纤维肉瘤细胞系取自ATCC (Manassas, VA)。人角膜上皮细胞(HCEC)获得了K. Araki Sasaki(日本熊本Tane纪念眼科医院眼科研究所)的许可。
所有细胞株以100 μL/孔(HCEC和3T3细胞用MMC预处理)的浓度接种，将平板置于5% CO的细胞培养箱中2， 37°C，湿度托盘)允许细胞粘附。孵育后，小心地取出插入物，用细胞培养基轻轻冲洗孔，细胞接受新鲜培养基。然后，细胞被孵育不同长度的时间，以允许迁移。然后用0.5 mM Calcein AM在PBS中染色30分钟，用PBS冲洗，然后晒干一夜。使用Agilent BioTek Synergy HT多模读取器测量每口井的荧光信号量。2022世界杯附加赛决赛
结果与讨论
初步实验显示细胞迁移到中心分析区。用mytomycin C (MMC)预处理HT1080细胞2小时以抑制细胞增殖，然后用2.5 mM细胞追踪器Green染色。在含有10%胎牛血清(FBS)的培养基中，以50,000细胞/孔的速度将细胞接种，并使其粘附。取出插入物，培养板以允许细胞迁移。如图2所示，FBS刺激的非增殖HT-1080细胞在去除掩膜21小时内几乎完全填充分析区。此外，当观察迁移时间时，在不到4小时内可以检测到迁移，在FBS存在的情况下，在28.5小时内是线性的(图3)。
图2。FBS存在下HT-1080细胞迁移动力学。图像为t = 0和t = 21小时(无掩膜时)的荧光显微照片。细胞迁移的分析区被白色虚线所包围。
图3。用Oris细胞迁移实验证实HT1080细胞迁移动力学。在t = 0、1、2、4、6、22和28.5小时时，使用Agilent BioTek Synergy HT多模读取器对分析区荧光进行量化。2022世界杯附加赛决赛采用标准曲线和5参数Logistic拟合方程(5-PLE)将荧光信号转换为细胞号。每个时间点代表9口井的平均值和标准差。
采用SV-40转化的人角膜上皮细胞(HCEC)，研究血清浓度对细胞迁移的影响。用MMC预处理HCEC细胞，使其融合，并允许其粘附。取出插入物，在孔中加入不同浓度的FBS(0-10%)培养基，培养板24小时以允许细胞迁移。细胞用钙黄素AM标记，并使用Synergy HT多模读卡器在分析区进行荧光定量。如图4所示，FBS的刺激作用是剂量依赖性的。存在至少0.5%胎牛血清的细胞迁移明显高于不存在(0%)胎牛血清的细胞迁移。当使用表皮生长因子(EGF)刺激细胞迁移时，也观察到类似的结果。
图4。胎牛血清能刺激人角膜上皮细胞的迁移。每一列代表18口井的平均值±标准误差(SEM)。
如图5所示，当非增殖的HCEC细胞在没有胎牛血清的情况下被注入浓度不断增加的EGF时，观察到24小时后的剂量反应。使用Oris细胞迁移实验，在至少0.1 ng/mL EGF存在时，细胞迁移明显高于在没有EGF的情况下观察到的细胞迁移。
图5。表皮生长因子对人角膜上皮细胞(HCEC)的迁移刺激。每一列代表18口井的平均值±SEM。
研究了细胞活性抑制剂的作用。采用Oris细胞迁移实验检测肌动蛋白结合化合物Latrunculin A对NIH 3T3成纤维细胞迁移的影响(图6)。NIH 3T3成纤维细胞用5 μg/mL MMC预处理以抑制增殖，然后每孔接种25000个细胞并使其粘附。然后取出插入物，将含有10%胎牛血清的拉runculin A (0 ~ 1000 nM)添加到孔中，培养板以允许细胞迁移。细胞用钙黄素AM标记，并使用Synergy HT多模读卡器在分析区进行荧光定量。
图6。拉runculin A抑制NIH 3T3细胞的迁移。每一列代表9口井的平均值±SEM。阴性对照是指插入物在细胞播种后仍在原位，直到染色步骤发生时检测结束才被移除的孔。
如图6所示，Latrunculin A以剂量依赖性的方式抑制NIH 3T3细胞的迁移。当Latrunculin A对HT-1060纤维肉瘤细胞的作用进行研究时，观察到类似的剂量效应(图7)。将HT-1080纤维肉瘤细胞(30000细胞/孔)接种并粘附。取出插入物，在10%胎牛血清存在的条件下，将Latrunculin A (0 ~ 200 nM)添加到孔中，培养板以允许细胞迁移。用钙黄素AM标记细胞，用Synergy HT在分析区定量荧光。在孵育6小时时，100 nM的拉runculin A可以完全抑制HT1080的迁移。
图7。抑制HT-1080细胞迁移。每一列代表5口井的平均值±SEM。阴性对照是指插入物在细胞播种后仍在原位，直到染色步骤发生时检测结束才被移除的孔。
结论
Oris细胞迁移实验是一种新颖的96孔二维细胞迁移实验，它允许在单个检测板上筛选不同浓度的多种测试化合物。所提供的结果证明了它在研究多种黏附细胞类型中细胞运动调节剂的影响方面的效用。如图所示，Oris细胞迁移实验可用于检测和定量启动子(如FBS和EGF)和抑制剂(如拉runculin A)对NIH3T3、HCEC和HT1080细胞类型迁移的影响。它适用于终点和动力学细胞迁移研究。这种新的检测格式为高通量筛选用于调节细胞迁移的测试化合物提供了一种新的工具。
安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek Synergy HT多模式读取器能够从微板井的顶部或底部执行荧光测量。使用深度阻断滤波器提供波长特异性，阅读器能够忠实地检测低水平的荧光。因此，对于某些类型的细胞，可以在4小时内检测到细胞迁移到分析区。
参考
- 荒木佐佐木K，大桥Y，佐佐木T，林林K，渡边H，田野Y，韩田H;投资眼科视觉科学1995。sv40永垂不朽的人角膜上皮细胞系及其表征;36(3): 614 - 21。
由NIH/NIGMS资助，拨款# 2R44GM069026-03