RelA在受刺激巨噬细胞中的核易位

利用图像分析定量蛋白质从细胞质到细胞核的运动

作者: Paul Held，博士，应用部门实验室经理，BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT

摘要

作为先天免疫系统的关键组成部分，巨噬细胞通过toll样受体识别分子，如革兰氏阴性菌产物脂多糖(LPS)，对微生物做出反应。受体激活会刺激一个复杂的信号网络，其中包括NF-κB通路。在这里，我们用基于图像的分析定量了蛋白质RelA的核易位，这是NF-κB转录因子复合物的组成部分，在巨噬细胞中。

简介

先天免疫是宿主抵御感染的第一道防线，对适应性免疫的发展至关重要。虽然所有的白细胞都在免疫反应中发挥作用，但巨噬细胞是最有效的吞噬细胞，可以吞噬大量的细胞、细菌或其他微生物^[1]．细菌分子与巨噬细胞表面的受体结合，引发巨噬细胞通过“呼吸爆发”的产生吞噬并摧毁细菌，导致活性氧的释放。病原体还会刺激巨噬细胞产生趋化因子，从而将其他细胞召集到感染部位^[２]引起炎症^[3]．这些细胞表面受体称为toll样受体(TLRs)，是一种模式识别受体，可识别微生物源性分子或病原体相关分子模式(PAMPs)的保守结构，如细菌细胞壁成分、细菌DNA和病毒RNA。其中一种结合TLRs的成分是脂多糖(LPS)，它是革兰氏阴性菌的外膜成分，是单核细胞和巨噬细胞的有效激活剂。LPS已被证实可触发巨噬细胞大量分泌多种细胞因子，包括IL-1(4)、IL-6(5)和TNF-α(6)，这是通过NF-κB复合体转录改变的结果。RelA，或称p65，是这种复合体的一个亚基，通常存在于细胞质中，但在刺激后会转移到细胞核中。

蛋白质进入细胞核是一个严格控制的过程，涉及核孔复合体(NPCs)。尽管小分子可以不受调控地进入细胞核，但大分子蛋白质(如蛋白质)需要与被称为importins的运输因子结合才能进入细胞核^[7]．必须从细胞质导入到细胞核的蛋白质携带核定位信号(NLS)，它作为标记与导入蛋白结合。它们的组成多种多样，通常亲水，由暴露在蛋白质表面的一个或多个带正电的赖氨酸或精氨酸短序列组成。输入蛋白及其相关蛋白与核孔复合体相互作用，从细胞质穿过核膜进入细胞核。这一过程由ras相关的小GTPase Ran调节，它与细胞核内的进口-货物复合物结合，导致进口蛋白对其货物失去亲和力^[8]．

图1所示。RelA (p65)调控和易位原理图。

RelA是异二聚体复合体NF-κB的一部分。在经典的NF-κB活化和核易位过程中，RelA和p50与细胞质和细胞核中的各种蛋白相互作用(图1)。在失活状态下，RelA/p50复合体主要被胞浆中的IκBα (κB抑制剂)隔离。TNFα、LPS等因子作为激活诱导因子，IκBα在残基32和36处被磷酸化，通过泛素-蛋白酶体系统快速降解，RelA/p50复合体释放^[9]．i κ b是一种包含多个被称为锚结蛋白重复序列副本的蛋白质，通过这些锚结蛋白重复结构域，NF-κB蛋白的核定位信号(NLS)被掩盖，并保持它们在细胞质中处于不活跃状态^[10]．随着IκBα的丢失，RelA核定位信号暴露，NF-κB发生快速易位。在NF-κB核定位后，RelA/p50异二聚体作为转录因子，与多种基因启动子结合，参与许多生物学过程，包括白细胞活化/趋化、TNFIKK通路负调控、细胞代谢和抗原处理^[11]．

已经开发了一些工具来研究蛋白质核易位。一个这样的工具是RAW 264.7 G9单元(RAW G9)。这些细胞是经过修饰的小鼠巨噬细胞系，使用慢病毒转染系统组成性表达gfp标记的RelA^[12]．融合蛋白在未受刺激的细胞中分裂到细胞质中，在LPS激活后转移到细胞核中。

材料与方法

细胞

稳定表达RelA-GFP的RAW 264.7 G9细胞是Iain Fraser (NIAID)的慷慨礼物。DMEM(猫# 12430)，无酚红DMEM(猫# 31053)，荧光/ DMEM(猫# A18967)， FBS和谷氨酰胺，Pen/Strep来自Life Technologies黑边，透明底部96孔(猫# 3904)微板来自康宁。LPS溶液(P/N ALX-581-008-L001)得到Enzo Life Sciences。未处理的T-75组织培养烧瓶(P/N 15800)来自Nunc。

细胞培养

RAW G9细胞在DMEM中添加10%胎牛血清，2 mM谷氨酰胺培养基，在未处理的组织培养瓶中培养，在37°C加5% CO的潮湿培养箱中保持₂．培养在70%汇合时进行常规传代。在PBS中加入冷的2mm EDTA 5分钟分离细胞。

固定染色实验过程

在固定细胞实验中，使用总体积为100 μL的DMEM培养基，以每孔10000个细胞的数量将细胞播种到黑色、透明的底部96孔板中，孵育过夜。第二天，在100 μL的体积中加入2倍终浓度的不同浓度的LPS。激活后，用PBS洗涤2倍，然后用4%多聚甲醛PBS在rt固定15分钟。固定后，用PBS洗涤2倍，用Hoechst 33342 (10 μM)和Texas red-phalloidin (6.6 μM)在PBS(含0.1% Triton X-100)在rt染色30分钟。然后用PBS洗涤2倍，并加入200 μL PBS以保持成像时的水合。

活细胞实验过程

在活细胞动力学实验中，使用总容积为100 μL的无酚红培养基，将细胞以每孔10000个细胞的数量接种到黑边透明的96孔板中，并培养一夜。第二天，细胞用Hoechst 33342 (10 μM)在37℃下染色20分钟。细胞核染色后，用Fluorobright/DMEM培养基洗涤细胞1倍，再加入100 μL Fluorobright培养基。调整了DAPI和GFP通道的成像曝光设置。成像设置确定后，在100 μL Fluorobright/ DMEM培养基中加入不同浓度的LPS，立即开始动力学成像。

成像

实验培养使用配备DAPI、GFP和TR光立方体的Lionheart™FX自动显微镜(BioTek Instruments, Winooski, VT)成像。LED光源配合带通滤波器和二色镜提供适当波长的光。DAPI光立方使用337/50激励滤波器和447/60发射滤波器，GFP光立方使用469/35激励滤波器和525/39发射滤波器，TR光立方使用586/15激励滤波器和647/57发射滤波器。使用20x物镜每7.5分钟动态捕获活细胞图像，持续3小时。温度控制(37°C)和气体控制(5% CO₂)在成像过程中启用。

表1．成像和预处理参数。

图2。未处理和刺激的RAW G9细胞的比较。(A)漫画描绘了受体介导的刺激导致荧光基团从细胞质迁移到细胞核。(B)活的RAW G9细胞用Hoechst 33342染色，并用10 ng/mL LPS刺激前后60分钟成像。

分析

易位试验的基础是由于细胞刺激，荧光信号从细胞质到细胞核的运动(图2)。这些实验使用天生具有荧光的RelA-GFP嵌合体。细胞核和细胞质之间的相对荧光可作为评估刺激的一种手段。然而，RelA的本地化是一个动态的现象，不是全或无。在未受刺激的细胞中，RelA主要存在于细胞质中，但并非完全存在。随着LPS与Toll受体结合，RelA被允许在细胞核中转移和集中。

图3．用于自动图像计算NF-κB易位的细胞质和核掩膜的测定。(A)表达RelA-GFP嵌合体的活细胞用Hoechst 33342染色，在DAPI和GFP通道中成像。(B)通过DAPI信号的目标阈值识别主(核)掩码。(C)通过扩展初级掩膜确定二级掩膜(细胞质)。(D)对GFP信号的门限分析也应用于二次掩码。

该模型利用RelA-GFP嵌合体的荧光信号，通过双掩模分析进行定量定位。细胞(活的或固定的)用Hoechst 33342染色，并在DAPI和GFP通道中成像(图3A)。主掩码或核掩码使用DAPI通道的阈值分析来识别细胞核(图3B)。二级掩膜识别细胞质。该口罩是指从主口罩的外缘向外延伸核口罩(图3C)。进一步细化，使用扩展区域的GFP信号阈值排除背景荧光(图3D)。

表2。核面具参数。

背景压平后，采用双掩模图像分析识别受刺激细胞。首先利用DAPI信号上的荧光阈值和大小排除作为选择标准，将细胞核识别为初级掩膜(表2)。一旦初级掩膜对象被识别和计数，掩膜的轮廓被扩展为表示代表细胞质的次级掩膜(表3)。基于GFP荧光阈值进一步细化细胞质掩膜的次级掩膜。

表3。细胞质掩膜参数。

通过核(一级)和细胞质(二级)掩膜的识别，可以识别RelA核易位阳性的细胞。可以使用来自核掩膜的平均GFP信号与来自细胞质的平均GFP信号的比值来计算一个定制的度量(表4)。随着转位的增加，GFP荧光将从细胞质区迁移到细胞的核区。这反映在易位(TL)比率的变化上。

表4。基于图像的分析。

易位阳性细胞可通过亚群体分析鉴定。未处理细胞的TL比可用于确定易位阳性细胞。平均TL比加上2倍其标准差随后被用作易位阳性细胞的最小值(图4)。在大多数实验中，这个值通常接近2.5。TL比值高于此值的细胞标记为阳性，低于此值的细胞标记为阴性。然后使用初级掩膜计数(细胞计数)作为成像细胞总数计算阳性细胞的相对百分比。

图4．阳性细胞阈值的测定。阳性细胞的阈值标准由未处理对照孔的核与细胞质信号比确定。均值+ 2个标准差。

结果

这些数据表明，LPS可以刺激RelA-GFP嵌合体从细胞质到稳定表达该蛋白的RAW G9细胞的细胞核的易位。

图5。RelA-GFP在未处理和刺激的RAW G9细胞中的定位。RelA-GFP表达细胞用3ng /mL LPS刺激60分钟或不处理，然后用4%多聚甲醛固定。固定细胞用Hoechst 33342和TR-phalloidin染色30分钟后。染色后，细胞在DAPI、GFP和TR通道中使用20x物镜成像。图像表示图像区域的光学放大部分。复合图像描述了叠加的GFP和DAPI通道。

如图5所示，RAW G9细胞呈梭形，如图中phalloidin染色的细胞骨架所示。在未处理的细胞中，RelA-GFP主要定位在细胞质中，因为在细胞的长度中可以观察到GFP荧光。许多细胞的细胞核周围有荧光晕，核区绿色荧光蛋白含量相对较低。用3 ng/mL LPS刺激60分钟可导致GFP荧光信号从细胞质移动到细胞核。现在在核区观察到明亮的GFP荧光，在细胞质区信号减弱，从复合图像中观察到。这种巩固不是细胞形态改变的结果，因为细胞骨架在LPS刺激下显示出相同的纺锤形。另一项需要注意的是，在未处理的细胞中存在一定程度的刺激，有一小部分(通常<10%)显示大量的核GFP荧光。同样，不是所有的细胞似乎都受到LPS治疗的刺激，大约15%的细胞似乎是屈光的。

图6。用30 ng/mL LPS刺激RAW G9细胞的延时图像。

活细胞成像也可以在这个应用程序中使用相同的图像捕获、处理和分析指标。图6展示了在活细胞中LPS刺激下RelA-GFP向细胞核的动态运动。随着时间的推移，大量观察到的GFP信号从细胞质转移到细胞核。LPS照射60分钟后，大多数细胞有局限于细胞核的GFP荧光。在持续的刺激下，RelA保持在细胞核内。几乎所有的RelA-GFP荧光都是在刺激120分钟的细胞核中观察到的。
图像分析可用于量化随时间变化的刺激程度。以细胞核中GFP荧光平均值与细胞质中GFP荧光平均值的比值作为定义标准，可将细胞标记为RelA易位阳性或阴性。截止值由未受刺激的控制确定。如图7所示，约15%未处理的细胞表现出某种程度的核易位。在暴露于100ng /mL LPS的45分钟内，核易位阳性细胞的百分比迅速增加到80%以上。一旦达到最大的刺激，在暴露时间没有观察到减少。用较低浓度LPS处理的细胞，阳性细胞百分比的增长率较低，最大百分比也较低(图7)。

图7。LPS对RelA易位的动力学影响。用不同浓度的LPS刺激RAW g9细胞，动力学成像3小时。图像分析识别易位阳性细胞，并绘制阳性细胞百分比与运行时间。数据点表示8个测定值的平均值。

BioTek的Gen5™Microplate Reader and Imager软件可用于从图像分析后生成的动力学数据进行数据还原。如图8所示，Gen5可以确定每个LPS浓度的曲线下面积(AUC)或积分。请注意，AUC的计算可以对整个实验范围进行，也可以根据研究者所需的时间或图像周期进行总实验的一部分。

图8。正动能曲线的面积。每口井的曲线下面积(AUC)或动力学图的积分会自动计算，并根据LPS浓度绘制。蓝色条纹表示100 ng/mL LPS时的AUC，绿色和红色分别表示10 ng/mL和0 ng/mL。

由此得到的AUC值可用于显示LPS浓度对RelA核易位的影响。如图9所示，当在3小时内对细胞进行动态成像时，通过RelA易位测量，LPS与RAW G9细胞激活有浓度依赖关系。似乎有一个浓度阈值，因为在LPS浓度小于1 ng/mL时，很少观察到易位。

图9。LPS浓度对RelA动力学易位的影响。绘制出每种LPS浓度的AUC。

RAW G9细胞活化也可以作为终点测定，而不是在活细胞中或用多聚甲醛固定后进行动态测定。如图10所示，用不同浓度的LPS活化RAW G9细胞120分钟，得到相似的滴定曲线。固定经常导致GFP荧光的可变衰减，使准确的结果比较困难。

图10。固定细胞和活细胞LPS滴定法的比较。从活细胞成像和固定细胞成像实验中绘制不同浓度LPS暴露120分钟时阳性细胞的百分比。数据点表示8个测定值的平均值和标准差。

时间实验可以在固定细胞和染色细胞上进行，在固定前暴露于不同时间的LPS。使用相同的分析标准，图11展示了固定细胞暴露和可测量易位之间的延迟，这似乎与图7中所见的活细胞大致相同。

图11。LPS激活RAW G9细胞的时间过程。在用4%的PFA固定前，用30 ng/mL的LPS处理RAW G9细胞不同时间。固定细胞用Hoechst 33342染色后，如前所述成像。数据表示8个测定值的平均值和标准差。

同样，不同激活时间的LPS滴定可以在固定细胞中进行。图12展示了固定细胞的图像分析结果。就像动力学实验中对活细胞成像一样，固定细胞在初始激活和可测量的易位之间存在时间延迟，这种延迟不能通过增加药物浓度来克服。与活细胞动力学实验一样，当RelA从细胞质转移到细胞核时，存在LPS阈值和时间延迟。

图12。暴露时间和LPS浓度对固定细胞和染色细胞激活G9的影响。将RAW G9细胞暴露于不同浓度的LPS中，并持续不同的时间(分钟)。然后绘制出不同活化时间的滴定结果并进行比较。每个数据点代表4个测定值的平均值和标准差。

讨论

蛋白质进出细胞核的易位调节还不完全清楚。在这些研究中使用的细胞中产生绿色荧光蛋白标记的蛋白质，如RelA，可以对活细胞中的这种现象进行快速分析。之前的实验需要使用特定的抗体来识别蛋白质的位置。因此，在成像之前，细胞必须被固定，渗透和染色。

RAW G9细胞可用于监测活细胞和固定后的RelA易位。这两种方法各有优缺点。活细胞实验需要使用环境控制，如温度、湿度和CO₂．这些实验为每口井提供了大量的数据，因为可以对井进行多次成像以提供动力学信息。然而，有要求提供某种核标记或污点，以表示核面具。在长期实验中，这些污点有可能对细胞活力有害。固定细胞实验，在固定步骤之后使用核染色，不受这个问题的影响。一旦固定，这些细胞在成像方面不受任何时间限制，可以用标记的针对RelA以外蛋白质的特异性抗体进行检测。这些实验通常需要更多的样本进行时间实验，因为任何一口井只能用于单个时间点。

Lionheart™FX或Cytation™成像仪的成像能力，与Gen5™Microplate Reader和Imager软件相结合，提供了一种使自动易位实验变得容易的解决方案。为了提供足够的亚细胞分辨率，所使用的图像是用20x物镜拍摄的。如有必要，在寻找罕见事件时，可以利用蒙太奇成像结合图像拼接来增加细胞计数。Gen5 Microplate Reader and Imager Software具有必要的工具，可以通过使用双掩膜分析充分定量gfp标记的RelA的亚细胞定位。通过使用荧光信号阈值和大小排除在染核周围创建初级掩膜，核染色用于提供视野中细胞的总数。Gen5通过向外扩展初级掩膜产生次级掩膜，并结合信号阈值表示细胞质。一旦确定，这两个区域被用来指定RelA易位阳性的细胞群。

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