2022卡塔尔世界杯完整赛程参考资料-申请须知

利用荧光RNA原位杂交和细胞成像对细胞因子癌症生物标志物的多重检测

下载

相关产品:乐鱼平台入口世界杯2022赛程时间表 ，2022世界杯南美区预选赛

2016年2月18日

作者: Brad Larson, BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT;迪伦·马拉特和迈克尔·舒尔，Affymetrix公司.，圣克拉拉，加州

Affymetrix

简介

细胞因子在癌症的发展和进展、治疗和预后等多个方面发挥着重要作用。在肿瘤环境中，它们有助于肿瘤的发生、进展和凋亡。特异性细胞因子的表达也与增强的肿瘤细胞存活率和转移活性有关。虽然许多癌症相关的细胞因子已经被确认，但促炎细胞因子IL-6和IL-8与广泛的癌症相关，包括淋巴瘤、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌等。具体来说，在结直肠癌和前列腺癌患者中可以看到IL-6的表达增加1，2．IL-8也在前列腺癌细胞中表达，它的存在与这些细胞的转移潜力有关3.．在乳腺癌中也发现了同样的作用，IL-8的高水平表达增加了雌激素受体阴性乳腺癌细胞的侵袭性4．因此，分析细胞因子的表达可以作为一种重要的诊断工具和预测癌症预后。

荧光原位杂交(FISH)技术是在细胞内DNA或RNA水平上可视化核酸表达的常用方法。然而，定位RNA的荧光原位杂交由于灵敏度低、工作流程复杂、不能进行多重分析等问题受到了限制。

在这里，我们展示了一种独特的非放射性RNA原位杂交解决方案，在单细胞中，在单一转录本检测水平上，同时提供1到4个mRNA靶标的RNA灵敏度和多重分析。

然后使用一种新型细胞成像多模式阅读器很容易捕获从放大信号发出的荧光。该仪器具有多达四个荧光成像立方体的能力，可以使用该仪器完成多重检测。然后用细胞分析算法确定RNA表达水平。我们表明，该组合提供了一种高效、敏感和可重复的方法来检测重要的预测癌症生物标志物的存在。

测定原理

ViewRNA ISH细胞分析方法(图1)首先用蛋白酶固定、渗透和消化细胞，使靶标可达。然后，目标特异性探针集与每个目标mRNA杂交，后续信号扩增依赖于相邻寡核苷酸对的特异性杂交。信号放大，使用分支DNA (bDNA)技术，通过一系列顺序杂交步骤发生。前置放大器分子杂交到各自的寡核苷酸对，然后多个放大器分子杂交到各自的前置放大器。多个标记探针寡核苷酸偶联到荧光染料上，然后与相应的放大分子杂交。当该结构完全组装时，每个标签探针有400个结合位点，当探针集中所有靶向特异性寡核苷酸与目标mRNA转录本结合时，该转录本将发生8000倍的扩增。然后使用Cytation™5细胞成像多模式阅读器检测每个扩增探针组的荧光信号。

QuantiGene®ViewRNA检测程序

图1所示。QuantiGene®ViewRNA检测程序

材料与方法

材料

分析和实验成分

QuantiGene ViewRNA ISH细胞检测试剂盒(目录编号:QVC0001)， Human IL6 ViewRNA®探针(目录号;va -13526)， Human IL8 ViewRNA探针(目录编号:VA4-13193)、Human ACTB ViewRNA探针(目录编号:VA6-10506)是由Affymetrix (Santa Clara, CA)慷慨捐赠的。

U 0126(目录号1144)和重组人IL-1β(目录号201-LB-005)购自研发系统公司(Minneapolis, MN)。

细胞

HCT116结直肠癌细胞(目录编号;CCL-247)、MDA-MB-231乳腺腺癌细胞(目录编号:CCL-247);HTB-26)、DU 145前列腺癌细胞(目录号;HTB-81)从ATCC(马纳萨斯，弗吉尼亚州)购买。

Cytation™5细胞成像多模式阅读器

Cytation 5是一种结合自动化数字显微镜的模块化多模式微板阅读器。基于过滤器和单色仪的微板读数可用，显微镜模块提供高达60倍放大的荧光，亮场，彩色亮场和相位对比。该仪器可以在多达四个通道中进行荧光成像。Cytation 5特别强调活细胞测定，温度控制到65°C, CO2/ O2用于动力学分析的气体控制和双注射器。集成的Gen5™数据分析软件控制细胞增殖除了图像和细胞分析外，该仪器还用于使用DAPI、GFP、RFP和Cy5成像通道对ViewRNA检测进行20倍或40倍目标的荧光成像。

方法

细胞板

将HCT116、MDA-MB-231和DU 145细胞添加到聚l -赖氨酸包被的96孔成像板上，浓度为2.0 × 104个细胞/孔，37℃/5% CO孵育过夜2．阴性对照孔在37ºC/5% CO条件下血清饥饿18小时2用含0.1%血清的培养基代替完全培养基。

试验过程

根据刺激实验，从孔中取出培养基后，以2-0 ng/mL的浓度向DU 145细胞中添加IL-1β，覆盖板，在40℃下孵育3小时。在抑制剂实验中，除去孔内培养基后，在DU 145和MDA-MB-231细胞中以10-0 μM的浓度加入U 0126激酶抑制剂30分钟。如前所述，用IL-1β刺激DU 145细胞。孵育后，根据Affymetrix用户手册:QuantiGene ViewRNA ISH细胞检测用户手册(18801,Rev. A 110525)进行修改，根据Affymetrix技术说明:运行QuantiGene ViewRNA ISH细胞96孔板法的指南和程序修改(Rev. A 110701)进行修改，包括试剂量60 μL/孔，洗涤步骤量150 μL/孔。A. B.其他的修改包括优化洗涤步骤迭代从三个到一个，由于松散的粘附细胞。

结果与讨论

荧光标记mRNA的成像和分析

通过使用HCT116和MDA-MB-231细胞，证实了对肿瘤细胞系中表达的荧光标记mRNA分子进行精确成像的能力。阳性对照细胞保持在完全培养基中，阴性对照细胞血清饥饿18小时以降低细胞因子表达。添加ViewRNA探针阳性标记IL-6、IL-8和ACTB mRNA，以及DAPI核探针。在ISH细胞检测过程完成后，分别使用RFP、GFP、Cy5和DAPI荧光成像通道对探针进行成像。如图2所示，使用优化的曝光设置、20倍或40倍物镜和前面列出的Cytation 5成像通道，准确识别每个探针的荧光信号。

正、负对照井成像

图2。正、负对照井成像。放大20倍HTC116细胞图像(A)阳性对照(B)阴性对照。MDA-MB-231细胞的40倍图像(C)阳性对照(D)阴性对照。蓝色:DAPI染色核;绿色:标记的IL-8 mRNA探针;橙色:标记的IL-6 mRNA探针;红色:标记的ACTB mRNA探针。

为了量化细胞因子的表达，首先使用Cytation 5的DAPI通道进行细胞分析，以确定每个孔的细胞数量(图3A)。然后用适当的通道进行图像分析，测量每张图像背景上每个标记细胞因子探针集(IL-6或IL-8)的荧光信号(图3B)。然后用每个细胞的荧光信号比率来评估每种试验条件下细胞因子的表达(图4)。

每细胞荧光信号分析。

图3．每细胞荧光信号分析。(A)使用Gen5细胞分析在DAPI标记的细胞核周围放置物体掩膜;(B)荧光标记IL-8信号的图像分析。

MDAMB- 231细胞中IL-8表达和HCT116细胞中IL-6表达的每个细胞荧光信号。

图4。MDAMB- 231细胞中IL-8表达和HCT116细胞中IL-6表达的每个细胞荧光信号。

图2中的图像和图4中的每个细胞荧光信号值表明，使用ViewRNA ISH细胞试验和细胞分化法可以准确定量阳性对照细胞中IL-6和IL-8 mRNA的表达。此外，血清饥饿细胞的信号减少也证实了细胞因子表达的变化。

细胞因子mRNA表达的诱导

按照实验程序，已知的刺激因子IL-1β以剂量依赖的方式添加到DU 145细胞中，以测定细胞因子mRNA表达的诱导。虽然IL-6和IL-8细胞因子的mRNA表达增加(图5)，但IL-8的表达对IL-1β刺激更敏感(图6)，这与之前发表的报道一致5．这验证了分析和评估方法产生准确结果的能力。在IL-1β的最高剂量下，这两种细胞因子的表达减少可归因于细胞毒性。

IL-1β作用于DU 145细胞。

图5。IL-1β作用于DU 145细胞。20x叠加图像显示IL-6、IL-8和ACTB荧光mRNA探针信号和DAPI染色的细胞核，孵育3小时(A) 0;(B) 0.02;(C) 0.128;或(D) 0.8 ng/mL IL-1β。蓝色:DAPI染色核;绿色:标记的IL-8 mRNA探针;橙色:标记的IL-6 mRNA探针;红色:标记的ACTB mRNA探针。

IL-1β刺激后DU 145细胞中IL-6和IL-8 mRNA的表达。

图6。IL-1β刺激后DU 145细胞中IL-6和IL-8 mRNA的表达。

细胞因子mRNA表达的抑制

独立研究表明丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)调节IL-8，并证明用MAPK/ERK抑制剂U 0126处理可以减少DU 145和MDA-MB-231细胞中炎症细胞因子的表达5、6．为了证实这一现象并验证检测和分析过程监测细胞因子抑制的能力，将不同浓度的U 0126添加到每种细胞类型中并孵育30分钟。1 ng/mL的IL-1β刺激DU 145细胞3小时，MDA-MB-231细胞不受刺激。孵育后，在所有测试孔上使用GFP和RFP成像通道完成细胞计数和图像分析，分别评估u0126处理后IL-8和IL-6细胞因子mRNA的表达。

图像(图7)和计算的每个细胞荧光信号值(图8)证实了u0126对IL-8炎症细胞因子mRNA表达的影响。此外，结果验证了ViewRNA ISH细胞分析和Cytation 5进行的基于图像的分析的敏感性，可以准确识别抑制分子处理后mRNA表达的变化。

u0126抑制IL-8 mRNA表达。

图7。u0126抑制IL-8 mRNA表达。u0126处理(A-E) MDAMB- 231后，显示IL-6、IL-8和ACTB荧光mRNA探针信号和DAPI染色核的20x叠加图像;或(F-J) DU 145细胞。蓝色:DAPI染色核;绿色:标记的IL-8 mRNA探针;橙色:标记的IL-6 mRNA探针;红色:标记的ACTB mRNA探针。

u0126处理MDA-MB-231和DU 145细胞后IL-8和IL-6 mRNA的表达。

图8。u0126处理MDA-MB-231和DU 145细胞后IL-8和IL-6 mRNA的表达。

结论

来自Affymetrix的ViewRNA ISH细胞检测试剂盒和探针提供了一种敏感的方法来检测mRNA表达的基础变化，以及在刺激或抑制分子处理后的微妙变化。此外，每个ViewRNA探针的特异性和Cytation 5的多通道荧光成像能力允许在单一成像程序上同时成像和分析多个探针。Cytation 5与Gen5数据分析软件固有的荧光成像和细胞/图像分析的结合，提供了一种可靠的方法来精确计算每个探针的每个图像中的细胞数量的荧光信号。最后，检测、成像和分析相结合提供了一种敏感、灵活和高通量的方法来检测重要的癌症相关细胞因子生物标志物的mRNA表达。

参考文献

  1. Komoda h;田中,y;本田、m;松尾y;Hazama k;结直肠癌组织中白细胞介素-6的水平。世界医学杂志，1998,22(8)，895-898。
  2. Culig z;白细胞介素-6:人前列腺癌中的多功能靶向细胞因子。中国生物医学工程学报，2012,32(1)，52-58。
  3. Aalinkeel r;Nair议员;Sufrin g;Mahajan金丝;kc查达;Chawda r;血管生成因子的基因表达与前列腺癌细胞的转移潜能相关。中华癌症杂志2004,64(15)，5311-5321。
  4. Freund, a;Chauveau c;摩根大通(J.P. Brouillet;卢卡斯,a;Lacroix, m;Licznar, a;Vignon f;Lazennec, G. IL-8表达及其与乳腺癌细胞雌激素受体阴性状态的可能关系。中华肿瘤杂志，2003,22(2)，256-265。
  5. ．Kooijman r;Himpe大肠;Potikanond,美国;胰岛素样生长因子- i和炎症细胞因子对人前列腺癌细胞中白细胞介素-8表达的调节。中国生物医学工程学报，2007,31(5):383-391。
  6. Chelouche-Lev d;米勒,C.P.;泰雷兹,c;鲁伊斯,m;Bar- Eli, M.;乳腺癌中不同的信号通路调节VEGF和IL-8的表达:对治疗的意义。中华癌症杂志，2004,40 (16)，2509-2518

AN021816_04

链接