利用上皮性卵巢癌细胞系进行IL-6分泌和细胞活力的多重检测

使用Agilent 2022世界杯附加赛决赛BioTek Cytation 3细胞成像多模式阅读器，使用htf检测监测IL-6分泌，使用数字广角荧光显微镜监测细胞活力

作者: Brad Larson和Peter Banks, Nicolas Pierre，CisBio美国公司；斯蒂芬妮·乔治奥,恩佐生命科学

表皮生长因子受体(EGFR)在70%的上皮性卵巢癌(EOCs)中表达。在EOC患者腹水中也发现了高水平的IL-6。配体刺激的egfr激活的nfkb依赖的转录和促炎IL-6细胞因子的诱导分泌已被证实。本应用笔记演示了EGFR和NFkB水平的抑制剂的多重检测，以监测IL-6的分泌和细胞活力。多重检测的工作流程使用一个检测板和一个HTRF检测板。细胞处理后，将上清转移到HTRF检测板上，在那里测定IL-6浓度;然后，利用荧光探针和成像技术在检测板上评估细胞活力。所有检测均在Agilent BioTek Cytation 3细胞2022世界杯附加赛决赛成像多模式阅读器上进行。

简介

根据美国疾病控制与预防中心(CDC)的数据，美国每年约有2万名女性患卵巢癌。¹在这些癌症中，90%被归为“上皮性”，并被认为起源于卵巢表面(上皮细胞)，被称为上皮性卵巢癌(EOC)。虽然预后对疾病I/II期的早期诊断很好，但症状是非特异性的，难以追踪。大多数卵巢癌在III/IV期晚期被诊断，此时症状变得更加明显。不幸的是，在这一点上，预后很差。在EOC进展的晚期，常见的表现是腹腔积液(腹水)。研究表明，这种腹水中存在高水平的IL-6。²

IL-6高表达的起源与受体表皮生长因子受体(EGFR)有关。EGFR在高达70%的EOCs中表达，其表达改变与晚期疾病和不良预后有关。^3.EGFR是受体酪氨酸激酶ErbB家族的一员，可激活多种信号级联反应，包括NFkB的激活，NFkB可激活炎症相关蛋白如IL-6的转录。⁴在最近的一篇论文中，EGFR配体结合在晚期EOC中通过NFkB途径诱导IL-6的表达。⁵

本应用笔记演示了一种体外微板试验，可以监测通过EGFR配体结合和NFkB激活诱导的被镀SKOV-3卵巢癌细胞中IL-6的分泌。检测流程涉及2板协议，其中细胞被镀和EGFR配体激活。IL-6的测量是通过转移细胞上清液的一部分在一个单独的微板中进行的。IL-6的分泌可以通过已知的抑制剂在EGFR或NFkB水平上被抑制。对被镀细胞有潜在毒性的抑制剂可以通过使用荧光探针的数字广域荧光显微镜进行评估。这提供了一个定量的确定IL-6抑制是由受体/转录因子激活抑制引起的还是通过细胞毒性引起的。所有微板测量均在Agilent BioTek Cytation 3细胞成像多模式阅读器上2022世界杯附加赛决赛进行。

材料与方法

材料

细胞:卵巢癌SKOV-3细胞(部分号AKR253)来自Cell Biolabs, Inc. (San Diego, CA)。细胞在RPMI 1640培养基(部件号11875)+胎牛血清，10%(部件号10437)和来自Life Technologies (Carlsbad, CA)的青霉素-链霉素-谷氨酰胺，1x(部件号10378)中繁殖。细胞以1.0 × 10的密度被镀⁵细胞/mL在无血清培养基中培养24小时。

EGFR信号级联诱导剂:来自ProSpec (Rehovot, Israel)的表皮生长因子(EGF)(部件号CYT-217)被用于刺激EGFR信号级联，导致促炎细胞因子IL-6的最终分泌。

抑制剂:AG 1478(零件号1276)、豆蔻素(零件号2509)、U0126(零件号1144)和LY 294002(零件号1130)从研发系统公司(明尼阿波利斯，MN)购买。西妥昔单抗由Cisbio Bioassays (Codolet, France)提供。抗egfr抗体225(部分编号LS- c88001)和111.6(部分编号LS- C88141)从LifeSpan BioSciences (Seattle, WA)购买。

细胞板:96孔扁平透明底，黑色PS, TCTreated微板(零件号3904)和384孔低体积白色圆底PS NBS涂层微板(零件号3673)采购自康宁生命科学公司(Corning, NY)。

仪表

2022世界杯附加赛决赛Agilent Biotek Cytation 3细胞成像多模式阅读器:细胞分化3结合了自动数字广角显微镜和传统的微板检测。该设计提供了丰富的表型细胞信息和基于井的定量数据。

Cytation 3配备了安2022世界杯附加赛决赛捷伦BioTek混合技术用于微板检测，包括高灵敏度的基于过滤器的检测和灵活的基于单色仪的系统，具有无与伦比的多功能性和性能。可升级的自动化数字荧光显微镜模块为研究人员提供了丰富的细胞可视化分析，而不需要标准的基于微板的成像仪的复杂性和费用。

荧光显微镜是一种强大的技术，可以可视化细胞反应，了解细胞增殖、蛋白表达、细胞毒性和其他细胞过程。执行常规定量荧光测量和细胞成像的能力提供了独特的功能，如筛选荧光强度阈值的微板孔，触发阅读器跟踪筛选，对超过强度阈值的孔进行成像。通过成像那些通过强度阈值的井，可以减少分析时间和数据存储需求。

Cytation 3设计特别强调活细胞检测。功能包括温度控制到45°C, CO₂/ O₂气体控制，轨道震动，并充分支持动力学研究与安捷伦BioTek Gen5数据分析软件，专门设计使板阅读和图像捕捉更容易。2022世界杯附加赛决赛其他技术进步在Cytation 3中也得到了体现，包括高强度LED光源、匹配滤光立方体、硬涂层光学滤光片、奥林巴斯物镜和完全软件控制数字显微镜的高级自动对焦。

基于过滤器的系统被用于检测HTRF IL-6化学试剂的665和620 nm荧光发射，设置如下:平板移动后延迟:0 msec;激发后延迟:150 μ sec;集成时间:500 μ s;读取高度:10.5毫米。然后使用显微镜功能进行核id蓝/红细胞活力测定成像。2022世界杯附加赛决赛使用安捷伦BioTek Gen5软件进行初始数据分析。

分析化学

HTRF人IL-6测定:在该试验中，IL-6的测定采用了包含两种单克隆抗体的夹心免疫分析法:用Eu-cryptate标记的抗IL-6 (MAb1)和用XL665标记的抗IL-6 (MAb2)。这些抗体可以在一个分配步骤中预混和添加，以进一步简化协议。实验分两步进行(图1)。在第一步(刺激)中，细胞与激活剂和抑制剂一起孵育。在第二步(检测)中，将含有分泌的IL-6的上清转移到第二个平板上，然后添加抗体。

核识别蓝/红细胞活力测定:来自Enzo生命科学公司(Farmingdale, NY)的核id蓝色/红色细胞活性试剂(部件号ENZ-53005)是一种蓝色荧光细胞透性核酸染料和红色荧光细胞不透性核酸染料的混合物，适用于染死核。存活细胞的细胞核会染成蓝色。随着细胞活力下降，细胞膜失去完整性，红色荧光染料就能染色细胞核。这两种染料同时结合产生的染色模式允许荧光显微镜测定活细胞和死细胞群。

图1．双板HTRF人IL-6测定。

方法

双板检测方案:将体积为100 L的SKOV-3细胞添加到96孔细胞板中，在无血清培养基中培养24小时。然后在孔中加入50µL的3x EGF或25µL的6x EGF和抑制剂，孵育适当时间。孵育后，16µL的上清液被转移到一个单独的低体积384孔板。然后加入4微升的HTRF抗体混合物，孵育4小时，然后读取

将剩余的培养基从细胞板中除去，用1x PBS洗涤一次。然后将含有核id试剂的50微升PBS添加到孔中，在37°C/5% CO中培养₂30分钟。完成后，用PBS洗涤两次，在成像前向孔中添加最终体积为50 μ L的PBS。

F(%)的计算:
((HTRF值(测试井)- HTRF值(Neg Ctl))/HTRF值(Neg Ctl)) × 100

EGFR通路刺激优化:我们进行了一项初步实验，以评估EGFR信号通路刺激后IL-6的分泌水平。从2000 ng/mL的1倍浓度开始，使用连续1:4稀释法建立了人体EGF的11点滴定法。将生长因子添加到SKOV-3细胞中，孵育24、48、72或96小时。然后按照前面解释的方法进行HTRF IL-6试验的其余部分。

EGFR途径抑制剂确认:小分子和抗egfr抗体抑制剂被测试其减弱IL-6分泌的能力和细胞毒性特性。化合物包括EGFR抑制剂AG 1478、抗炎小豆蔻素(已知可抑制NFkB激活)、MAP激酶抑制剂U0126和PI3激酶抑制剂LY 294002。三种已知人类反应性的抗egfr抗体225、111.6和西妥昔单抗也纳入研究。将抑制剂和EGF添加到SKOV-3细胞中，并在进行IL-6和细胞毒性试验之前共培养48小时。

Gen5 2-plate microplate reader/imager HTRF IL-6和细胞毒性协议:使用安捷伦BioTek Gen5软件创建了一个单一的2板协议，以实现HTRF分析板和细胞板的高2022世界杯附加赛决赛效处理，并消除了对整个细胞板成像的需要，因此避免了不必要的数据生成和存储。在Gen5中为HTRF分析板创建的板布局确定了对照孔和测试孔的位置(图2A)。数据分析步骤还将原始荧光数据转换为δ F(%)，并识别抑制IL-6分泌≥50%的“命中”孔(图2B)。

使用HTRF分析板读取后进行的数据还原和截止分析，确定了证明IL-6分泌抑制≥50%的孔(图3)。

在与生成htf结果相同的实验文件中，在原始细胞板中选择孔来评估感兴趣的抑制剂浓度的潜在细胞毒性效应(图4)。

然后捕获用核识别细胞活性试剂染色的活细胞核和死细胞核的4倍和20倍图像(图5)。

然后使用细胞分析工具来确定每个4x图像中捕获的活细胞和死细胞的数量。物体大小和阈值荧光值标准用于确保每次计数选择适当的细胞(图6)。

图2。(A)安2022世界杯附加赛决赛捷伦BioTek Gen5平板布局用于HTRF IL-6 384孔分析。(B)原始荧光值转换和阳性抑制井确定的数据还原步骤。

图3。抑制数据的截止分析结果。显示δ F(%)值≤最大增产井(用红色标记)的50%的井。所有其他的井都用绿色标记。

图4。选择用于细胞板(板2)成像的单个板布局。

图5。所选井的4倍蓝色和红色图像缩略图。

图6。2022世界杯附加赛决赛Agilent BioTek Gen5细胞分析成像工具。

结果与讨论

EGFR通路刺激

多日通路刺激分析的结果(表1)表明，与血清饥饿的SKOV-3细胞孵育48小时的EGF在含有受刺激细胞和未受刺激细胞的孔(或分析窗口)之间提供了最大的信号变化。

表1。多孵育时间EGF刺激试验窗口。

24小时的孵育时间可能不足以看到IL-6分泌的峰值刺激，而在延长的孵育时间(如72和96小时)后，细胞因子可能开始被SKOV-3细胞降解。因此，48小时的孵育时间将用于抑制剂测试。

从48小时的刺激曲线(图7)可以看出，最大的刺激发生在1到100 ng/mL EGF之间。浓度为35 ng/mL用于后续的抑制分析。

图7．EGF刺激IL-6分泌。EGF与SKOV-3细胞孵育48小时后IL-6分泌刺激曲线

EGFR途径抑制剂的确认

所有化合物和抗egfr抗体的抑制曲线由Gen5软件使用原始620和665 nm发射信号计算的δ F(%)值绘制(图8)。

图8。抑制IL-6分泌(A)小分子抑制剂和(B)抗egfr抗体。

虽然在所有测试的抑制剂中都可以看到IL-6分泌的减少，但在AG 1478、豆蔻素和西妥昔单抗中可以看到更显著的减少。这与之前的研究结果一致，即受体和NFkB通路激活水平的抑制导致egf刺激的IL-6分泌随后下降。⁵U0126和LY 294002对SKOV-3细胞没有明显的抑制作用，表明配体依赖性的EGFR/MEK/ERK和EGFR/PI3K/ AKT激活对IL-6分泌的作用减弱。最后，与其他抗egfr抗体相比，西妥昔单抗的有效性提高也与之前的比较结果一致。⁶

通过从截止分析中确定的原始细胞板的预定孔中捕获活细胞和死细胞的4x和20x图像来评估抑制剂的细胞毒性效应(图9)。还对其他孔进行成像，以确定识别的IC的潜在细胞毒性₅₀值，也适用于无复合、阴性对照井。

图9。(A) AG 1478的4倍活/死细胞图像。除IC外，还显示了两个预选井的图像₅₀浓度和无抑制剂对照。(B)显示细胞形态和染色细胞核的20倍蓝/亮场图像。

通过对4x图像进行细胞分析(图6)，生成了细胞毒性曲线。

活/死细胞成像结果表明，细胞毒性作用在IC是最小的₅₀使用48小时潜伏期时确定的浓度(图10)。只有在测试的小分子抑制剂浓度最高时，细胞活力才会明显下降。最后进行了一个实验，以确认抗egfr抗体的受体结合。将各一抗分别加入SKOV-3细胞，然后加入xl665标记的山羊抗人Fc抗体。当1°抗体:受体和2°抗人Fc抗体结合时，预期会出现红色荧光图像(图11)。

仅使用西妥昔单抗可观察到EGF受体与抗人Fc抗体的结合。这是由于抗体包含人源化Fab和Fc区域。225和111.6抗体来自小鼠，因此仅在Fab区显示人类反应性。阴性对照(无1°抗体)也未见结合，证实2°抗体的非特异性受体结合未发生。

图10。计算使用(A)小分子和(B)抗egfr抗体抑制剂测试的所有浓度的活/死细胞比率。

图11。抗egf受体抗体结合20x图像。蓝色表示dapi染色的细胞核。绿色为phalloidin actin染色。

结论

HTRF IL-6检测为评估癌细胞模型的细胞因子分泌提供了一种易于使用、敏感的方法。当使用2板协议运行时，该试验可以与核识别蓝/红细胞活力试验进行复用，以快速评估活细胞和死细胞群。安捷伦BioTek Cytation 3细胞成像多模式阅读器的综合2022世界杯附加赛决赛功能提供了使用一台仪器轻松执行每种检测的能力。先进的光学和安捷伦BioTek Gen5数据分析2022世界杯附加赛决赛软件功能确保了基于阅读器和显微镜分析的准确检测，并提供了整个实验工作流程的高效性能。

参考文献

1. 美国疾病控制与预防中心妇科癌症、卵巢癌网页:http://www.cdc.gov/cancer/ovarian/index.htm
2. 李志强，李志强，李志强(2000)。卵巢癌中IL-6的产生与肿瘤的组织类型和生物学特征有关，并影响局部免疫。乳腺癌杂志82:621-628。
3. 王晓燕，王晓燕，王晓燕。(2009)。卵巢癌中激活的表皮生长因子受体。癌症治疗决议149:203-226。
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5. Alberti C, Pinciroli P, Valeri B, Ferri R, Ditto A, Umezawa K, Sensi M, Canevari S和Tomassetti A.(2012)。在晚期上皮性卵巢癌中，配体依赖的EGFR激活通过NFkB途径诱导IL-6和PAI-1的共表达。癌基因31,4139 - 4149。
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