2010年11月17日
作者: Paul Held博士，首席科学家，BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT .应用部门
酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)在啤酒、面包和葡萄酒等许多主食的生产中发挥着关键作用。啤酒或葡萄酒酵母的发酵过程将糖、氨基酸、多肽、蛋白质、核酸和许多其他化合物的复杂混合物转化为酒精、二氧化碳和饮料所需的口味。要想可靠地、反复地获得所需的产品，不仅需要仔细监测输入材料，还需要在这一过程中仔细监测酵母菌株的生长。同样，新菌株的发展往往需要监测菌株在各种条件下的生长。这里我们描述一下的用法协同™H1混合多模式微板阅读器提供温度控制，溶液搅拌，并使用96孔微板光散射监测细胞酵母生长。
简介
酵母是单细胞真核真菌，通过出芽或分裂进行无性繁殖(图1)。虽然酵母的大小不同，但其直径通常为3-8 μM。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是科学研究、烘焙和发酵中最常用的菌种，已经成为酵母术语的同义词。
图1．酿酒酵母
酵母发酵酒精已有几千年的历史。在法老的坟墓中发现的绘画描绘了埃及人使用酵母发酵酒精饮料和发酵面包，记录了酵母的使用至少5000年[1]。直到18世纪，生物科学才发展到足以识别酵母生物，并推断出糖发酵成乙醇的过程中会释放出二氧化碳作为副产品。
从那时起，面包师、科学家和酵母制造商就一直致力于识别满足特定需求的酵母菌株。
酵母生长阶段:
当培养用于啤酒发酵时，培养中的酵母细胞遵循一个非常可预测的生长模式，可以很容易地分为四个阶段:(1)滞后;(2)日志;(3)减速;(4)静止。在滞后阶段，没有生长发生的新调酵母成熟和适应环境。接下来是对数期，细胞快速生长和分裂。营养物质相对于细胞数量过剩，废物被充分稀释到微不足道。这一阶段的生长速率将遵循一级动力学。随着细胞数量的增加，细胞的生长开始减慢，因为一些参数(例如底物和废物)，每一个都具有饱和效应，变得重要。最终，酵母细胞达到固定阶段，由于废物浓度高或完全消耗底物，没有生长(图2)。
图2．典型的酵母生长曲线。酿酒酵母在30°C的YPD培养基中生长12小时，每2分钟测量一次数据。
芽殖酵母细胞分裂的克隆性质允许筛选大量的有机体，以寻找表现出所需特征的突变体。单个突变体从单个祖先无性复制和分裂。当选择酵母菌株为所需的生长特性，这样做的一个方法是在选择性条件下监测生长。我们已经使用Synergy™H1混合多模式阅读器来维持温度，提供持续的眼眶震动，并执行吸光度测量，以监测酵母细胞在各种不同条件下的生长。
材料与方法
YPD培养基粉末、氯化钠、单碱性和双碱性磷酸盐和乙醇来自Sigma-Aldrich(圣路易斯州)。YPD培养基按指示制备并经高压灭菌。无菌菌落在底部透明微板上，目录号3598，来自康宁(Corning, NY)。光学透明TopSeal®-A板封胶，目录号6005185，来自PerkinElmer (Boston, MA)。不同的酵母菌菌株来自w酵母实验室(Odell, OR)。所有的实验都遵循相同的一般格式。隔夜培养基(50毫升)在250毫升的Erlenmeyer烧瓶中生长，温度30°C，眼眶振荡，转速125转。在进行生长实验之前，用新鲜的1X YPD培养基将每个隔夜培养基150 μL稀释为7.5 mL。然后根据需要将稀释的细胞镀到康宁3598平底透明板中。每2分钟测量一次，采用连续的轨道振动模式。 Shaking speed was set to slow and frequency set to 559 (1 mm amplitude). Temperature control was enabled and, unless stated otherwise, was at 30°C. Cell growth was assessed by light scatter measurements made at 600 nm [2]. The absorbance of each well was read kinetically using a Synergy™ H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader (BioTek Instruments, Winooski, VT). Reader was controlled and data collected usingGen5™数据分析软件(BioTek Instruments, Winooski, VT)。
结果
细胞数量的影响以ppd培养基为稀释剂，对2000株Budvar贮藏啤酒酵母进行过夜培养。将每种稀释剂的等分(200 μL)重复8次移至微板中，测定其在600 nm处的吸光度。由此得到的吸光度测量表明吸光度随细胞数量的增加而增加(图3)。由于检测到细胞悬浮液是光散射的结果，而不是真正的吸光度，因此响应不服从比尔定律，不一定是线性的。这些数据最好用二阶多项式来描述。
图3．2000株Budvar啤酒酵母菌的吸光度。
增长的一致性
在整个培养皿中可重复生长的酵母细胞对于比较研究是必要的。当将一株2000年的Budvar啤酒酵母培养物置于96孔板的所有孔中，所有孔中的生长模式(图4)。如前面所述，用YPD培养基稀释过夜培养物，并向96孔板的每孔转移200 μL。在这些培养物中，600 nm处的平均初始吸光度为0.156,CVs为2.6%。实验完成20小时后，平板上的平均吸光度为1.516,CVs为1.5%。单列和行分析显示，初始和最终吸光度结果相似。
图4。2000株Budvar酵母培养物的动力学吸收规律。
当对单井进行更详细的检查时，可以看出单井之间的差别很小。这不仅适用于初始和最终吸光度，也适用于中间数据点(图5)。所有井的平均测井相增长率为3.68 mOD/min。， CV为2.48%。这些数据表明，不同实验条件下的对数相生长率可以作为比较的手段。
图5．选定井中酵母生长的比较。动力学吸光度数据绘制了在30°C下生长的2000株Budvar贮藏啤酒酵母的所有96个单孔。
温度敏感性
生长温度对酵母的生长有显著影响。将四种不同的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)菌株进行稀释，并在22至6个96孔板中重复培养。每个培养皿都有四种酵母菌株和八个只含有YPD培养基的对照孔。在指示的温度下，在单独的读取器中对平板进行动态测量。如图6所示，从室温到37°C, Budvar贮藏啤酒酵母的生长几乎没有变化。在40℃下培养，延迟时间略有延长，但更重要的是，对数期的生长速率降低，固定期的细胞数量低于较低温度下观察到的细胞数量。当酵母细胞在45°C培养时，观察到几乎没有生长(图6)。在其他酵母菌菌株中也观察到类似的结果(数据未显示)。
图6．温度对2000株Budvar啤酒酵母菌生长的影响。酵母株2000 Budvar在指定的温度下平行生长。
通过将分析限制在生长的对数阶段，可以比较不同菌株的酵母菌之间的耐温性。当用每次吸光度的变化来测量对数相生长率时，可以观察到不同酵母菌株之间的生长率和耐温性有显著差异(图7)。
从吸光度的变化来看，两种贮藏型酵母菌在37℃以下生长速度最快。两种啤酒酵母菌株(1098和1469)在允许温度下生长速度较慢，对温度升高的耐受性较弱。
图7。温度对对数相生长速率的影响。
乙醇耐受性
酵母产生乙醇和二氧化碳作为糖发酵的副产物。乐鱼平台入口当废物的数量变得显著时，它的存在可能会对细胞生长造成损害。将4株酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)稀释过夜培养，每22个重复150 μL，置于96孔板中。在培养皿中加入50 μL的乙醇/YPD不同培养基混合物，使每个酵母菌菌株在每种乙醇混合物中重复两次。当乙醇的影响被检查时，很明显，高水平的乙醇对酵母生长有抑制作用。以2001年Urquell贮藏啤酒的生长为例，酵母对2.5%或更低的浓度相当耐受。在这些水平之上，可以观察到酵母菌株的生长明显下降(图8)。
图8．乙醇对2001株Urquell啤酒酵母菌生长的影响。
在其他酵母菌菌株的对数相生长率中也看到了类似的结果。2000株Budvar啤酒酵母菌是最耐受性的被测菌株，在5%乙醇浓度下生长速率没有下降。英国麦芽酒对2.5%的耐药率相当高，而其他两种菌株在任何乙醇的存在下均表现出较低的耐药率(图9)。
图9。自动分析性能数据。
pH敏感性
为了测试pH对酵母细胞生长的影响，将4株不同的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)的培养液稀释，并在96孔板上重复22次，每组150 μL。在培养皿中再加入50 μL的pH值为4.5 ~ 9.5的50mm磷酸盐，使每个酵母菌菌株在不同的pH值下重复两次。酵母在酸性条件下比在碱性条件下生长得更好。这是在对1469株蒂莫西·泰勒啤酒酵母的生长进行检查时产生的。当pH值从4.5到6.0时，生长速率与未缓冲的对照井几乎无法区分(图10)。在pH为6.5时，菌株生长较慢，但在固定阶段达到相同的细胞浓度，尽管它需要多花3-4小时才能达到这一水平。当pH值为7.0或更高时，菌株的生长速率和最终细胞密度均显著下降。
图10．pH值对1469株蒂莫西·泰勒啤酒酵母生长的影响。
当检测其他酵母菌菌株时，结果相当复杂。菌株2001和1098表现出与菌株1469相似的生长模式，而菌株2000表现出在碱性pH下的生长速率增加(图11)。有趣的是，在测试的所有pH值水平(数据未显示)下，所有四种菌株的感染率都略低于未监管对照井的记录。这表明磷酸盐的存在可能对酵母生长有全面的抑制作用。
图11．pH对对数相生长率的影响。
盐敏感性
与去离子水或蒸馏水相比，在使用公共供水或井水等未经处理的水时，生长介质的离子强度是一个值得关注的问题。虽然可以饮用，但这些水可能含有大量的离子。虽然这些“杂质”实际上可以增加水的实际味道，但它们也有可能增加味道或抑制酵母生长，这取决于它们的组成。酵母细胞在高浓度氯化钠的存在下表现出很大的耐受性。通过添加外源NaCl来评估离子强度对酵母细胞生长的影响。如前文所述，将4株不同的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)的过夜培养稀释，并在96孔板中重复22次，每组150 μL。再加入50 μL NaCl稀释剂，使最终氯化钠浓度在0 ~ 1.25M范围内。对照井注入50 μL水。每个酵母菌菌株在两次重复中加入不同浓度的氯化钠。
图12．氯化钠对2001株Urquell啤酒酵母菌生长的影响。
2001株Urquell啤酒酵母生长在NaCl浓度高达125 mM的环境中，与未处理的对照井相比，其生长模式几乎没有明显变化。这些浓度虽然是低渗透的，但可被认为相当于或改进只加水。250 mM和375 mM的盐浓度显示生长速率降低，但在20小时后仍能达到与未处理对照相似的细胞密度。在NaCl浓度高达500 mM时，酵母菌株显著生长(图12)。
计算了四种酵母菌株在盐浓度高达2.5M时的对数相生长率。不出所料，随着NaCl水平的增加，所有菌株的对数相生长率都有所下降(图13)。与许多其他实验一样，2000株Budvar在NaCl浓度为500 mM或更低时生长速度最快。有趣的是，在500mm以上的啤酒酵母菌株1469的生长速度最高，尽管与未经处理的菌株相比有很大的减少。
图13．氯化钠对木相生长速率的影响。
在这些实验中使用的酵母菌的菌株是经过数年的选择，以确定啤酒发酵的特定属性。除了生长，透明度、沉降、絮凝、产醇量(数量和类型)、风味和香气等特性都是选择菌种的重要因素。历史上，北欧生产的是在较低温度下发酵的拉格啤酒，而不列颠群岛生产的是艾尔啤酒。2000年的Budvar窖藏菌株表现出了最大的耐高温能力。虽然没有经过测试，但这表明它可能在比环境温度低的温度水平上也有优势。同样，1469 Timothy Taylor菌株在高离子强度溶液中具有活性的能力很可能是在英国经常发现的硬水的结果。
这些动力学数据的一致结果是几个因素的产物。为了使酵母在悬浮液中均匀生长，尤其是在/或接近脱落点的地方，整个培养皿的均匀温度控制是必要的。Synergy™H1的四区加热系统监测孵化温度，并从读取腔内的多个点提供热量，在整个板上提供均匀的温度。一个经常被忽视的点是蒸发和需要板封口剂。像这样的长时间动力学分析需要一种更好的防止蒸发的方法，而不是用微微板提供的标准板盖。使用胶粘剂密封是绝对必要的，以防止液体因蒸发而流失。
井内的液体体积也是一个重要的参数。过填井通常会导致板封与流体之间形成小气泡。由于光束衍射，这种气泡通常会引起“吸光度”测量的巨大变化。由于井中流体较少，因此存在较大的空气体积，使大量的流体蒸发，因为气隙被水蒸气饱和。除了减少酵母菌生长的液体外，这也增加了水凝结在井顶密封板内表面的可能性。这些液滴会引起类似于前面描述的气泡的问题。Synergy H1的孵化室在板的顶部和底部都有加热元件，最大限度地减少凝结形成。在我们手中，200 μL培养体积可以很好地用于96孔平底平板酵母生长研究。
为了使细胞保持悬浮状态，摇动方式和速度的选择是很重要的。酵母细胞的大小和结块的倾向需要使用眶摇来保持细胞悬浮。对于我们所检测的菌株，选择一个短振幅(1毫米)的缓慢设置(559 cpm)提供了足够的搅拌，使酵母在生长的所有阶段保持悬浮状态。这在固定阶段尤其重要，当酵母絮凝。不同的酵母菌株和/或不同的盘子类型需要不同的摇动设置与这里描述的不同。
这些实验使用了长时间的动力学运行来分析酵母菌株的能力。需要注意的一点是，尽管生长速率显著不同，但许多不同的培养条件导致了相同的最终细胞密度。这是一项在长时间潜伏期结束时无法确定终点的发现。Gen5™能够自动确定测井相动力学数据的平均变化率或MeanV，从而简化了数据分析。从运动运行中选择构成对数相位的特定数据子集可以在运行之前进行，并对运动数据的子集自动进行计算，从而消除滞后和固定相位。
这些数据证明了Synergy™H1在动态监测酵母细胞生长方面的效用。酵母培养需要恒定的温度和充分的搅拌，以获得一致的可重复的结果。除了为细胞生长提供足够的混合细胞营养悬浮液，保持均匀的悬浮液可以进行准确的光散射测量。Synergy H1有许多不同的震动特征，包括线性，轨道和双或图八震动模式。每个模式也可以调整速度和振幅，为不同的材料提供了许多不同的混合选项。
参考文献
- Jean-Luc Legras, Didier Merdinoglu, Jean-Marie Cornuet和Francis Karst。(2007)。面包、啤酒和葡萄酒:酿酒酵母的多样性反映了人类历史。分子生态学16(10):2091-2102。
- Stubbings, W.J, Bostock, J.M, Ingham, E.和Chopra, I.(2004)评估微板法测定抗生素后对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的影响，《抗菌化学杂志》54(1):139-143。
确认
我们要感谢保罗·黑尔博士为这些实验捐赠的酵母菌株。