2011年12月19日
作者:Peter J. Brescia, Jr和Peter Banks，应用部门，BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT
生产廉价纤维素乙醇的研究正在进行中，仍然为从玉米中提取乙醇的实际替代提供了希望。在这里，我们详细介绍了以试管和微板为基础的工作流程，以量化在木质纤维素材料转化为乙醇的中间产物葡萄糖。
介绍
虽然葡萄糖主要被认为是生物系统中无处不在的燃料来源，但它在生物燃料应用中作为乙醇生产的前体发挥着越来越重要的作用。葡萄糖是一种单糖，在自然界中作为单体被用于制造多糖，如植物中的淀粉和纤维素，以及动物中的糖原。虽然淀粉和糖原提供了一种容易获得的葡萄糖和能量来源;对于有效利用储存的能量来说，纤维素降解是一个更具挑战性的来源。目前，从生物质生产具有成本效益的商业生物燃料仍然难以实现。为此目的，目前正在花费大量的精力来设计和优化各种工艺，例如纤维素原料的发酵。对发酵过程中形成的中间产物进行量化，对于优化提高产品产量所必需乐鱼平台入口的步骤至关重要。监测葡萄糖(乙醇生产中的中间产物)形成的能力对于持续的商业运作至关重要。
一种定量测定葡萄糖的方法是使用如下所述的酶促方法(图1)。已知葡萄糖氧化酶可将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，同时释放过氧化氢。在这种酶促反应中过氧化氢的定量释放可以通过二次反应加以利用，包括在过氧化物酶存在的情况下还原无色的邻二苯二甲酸，从而形成有颜色的产物。氧化的邻二酸酐可通过与硫酸反应进一步稳定，产生一种强烈的粉红色，吸光度可测量到540 nm。最终产物和吸光度，与样品中发现的葡萄糖浓度成正比。在这里，我们使用基于试管和微板的工作流程，对纤维素酶降解羧甲基纤维素产生的葡萄糖进行了定量分析。
图1。葡萄糖浓度定量测定的酶法。葡萄糖氧化酶和过氧化物酶用于葡萄糖的顺序氧化和邻二苯二甲酸氧化为稳定的、着色的产品，能够被基于微板或比色皿的吸收光谱检测。
材料和方法
纤维素酶降解
纤维素酶(黑曲霉)、羧甲基纤维素钠和醋酸钠购自西格玛(St. Louis, MO)。在100 mM醋酸钠(NaOAc)缓冲液中配制浓度为5 mg/mL的羧甲基纤维素(CMC)工作溶液，pH=5.0，每日鲜制。纤维素酶工作液在NaOAc缓冲液中制备至10 U/mL。制备纤维素酶工作液1:2的串联稀释液，与CMC工作液按1:1的比例(v/v)混合，在37°C下孵育过夜。然后对酶促反应葡萄糖产物进行分析。
葡萄糖分析
葡萄糖(GO)检测试剂盒和硫酸从Sigma(圣路易斯，密苏里州)购买，并按照试剂盒制造商的说明进行以下修改。简单地说，葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂用39.2 mL ddH2O稀释，o-二苯二胺试剂用1 mL ddH2O重组。在葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂中加入0.8 mL的邻二酸酐试剂，避光处理。用硫酸(H2SO4)作为浓缩原液(12 N)，根据试剂盒中提供的NIST可追溯葡萄糖标准制备如表1所示的葡萄糖标准曲线。将测定量扩大到500 μL，即标准体积5 mL的10%，使用微板或微体积比色皿进行分析。简单地说，将100 μL葡萄糖标准品或样品添加到200 μL检测试剂中，在37°C下反应30分钟，然后加入200 μL硫酸。将100 μL或500 μL的标准品和样品分别在微孔板或微体积比色皿中测定，并使用Eon微孔板分光光度计控制Gen5™软件(图2)。数据分析是在Microsoft Excel (Redmond, CA)中完成的。
图2。工作流图描述了用纤维素酶从纤维素原料的酶降解中产生葡萄糖的两种小容量测定方法。
表1。葡萄糖标准曲线，0-100 μg/mL，由NIST可追溯葡萄糖标准生成，用于分析纤维素酶对纤维素原料的酶降解产生的葡萄糖。
结果与讨论
稀释系列中纤维素降解反应的等分物被稀释5-或20倍，使用25或5 μL的反应体积，到去离子水的最终体积为100 μL，用于葡萄糖氧化酶分析法分析。溶液吸光度在540 nm处在微板或小体积比色皿中读取，并绘制每个测量系列的线性部分(图3)。然后根据标准曲线计算葡萄糖浓度(图4)。
图3。吸收度测量代表纤维素酶稀释系列的线性部分。纤维素酶催化的5 μL或25 μL的1:2系列稀释纤维素降解反应系列通过葡萄糖氧化酶测定法进行分析。吸光度测量分别在微孔板和小体积比色皿中进行比较。
图4。从标准曲线计算出每个反应中的葡萄糖浓度，并将其与每个降解反应中的纤维素酶浓度进行对比。
如图4所示，无论分析的纤维素降解反应的体积或用于吸光度读数的测量容器的大小，计算出的葡萄糖浓度之间的相关性都很明显。在分析过程中容易改变样品体积的能力使实验者能够确保样品检测落在标准曲线的线性响应范围内。
结论
葡萄糖的酶促测定提供了一种特定的、灵敏的和快速的方法，以最少的样品制备定量来自各种来源的葡萄糖。在生物燃料研究领域，使用纤维素原料生成葡萄糖，并最终生成乙醇，有可能克服与使用其他生物质来源(如玉米)相关的一些成本。在生物加工过程中可靠地监测葡萄糖的产生是研究和开发新型发酵方法所需的关键步骤。分析的小型化能力提供了进一步的好处，如在各种条件下并行筛选大量过程的能力。带有比色管端口的Eon微板分光光度计提供了一个灵活的平台，可以在单一仪器中执行标准和小体积样品分析。
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