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使用Microplate Reader在2 μL体积内监测细胞生长

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2011年12月19日



作者: Peter Brescia, Keri Raymond和Peter Banks, BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT

培养中细胞生长的准确测定对许多下游过程至关重要，以确保获得最佳生长和产生足够的生物量。目前在科学过程中使用的细胞类型的多样性需要一种通用的方法来监测细胞生长。测定细胞生长的一种常见而快速的方法是使用比浊法。在这里，我们描述了一种适合的方法，使用microplate阅读器从低至2 μL的细胞培养中对各种类型的细胞进行微体积细胞定量。

简介

细胞培养是培养多种细胞类型的重要过程。常用的细胞类型包括细菌、酵母和哺乳动物细胞。这些为生产生物制剂、酒精饮料和药物发现和毒理学研究的体外模型系统等各种过程提供了起始材料。虽然所研究的菌株和细胞类型可能有很大差异，但浊度法仍然是测量细胞生长的一种常见和快速的方法。典型的光密度测量是在波长为600 nm时使用试管或微板阅读器进行的。选择波长的原因是，构成细胞培养基的许多成分在该波长下保持透明，因此光密度与光路中细胞的密度成正比。虽然浊度法不遵循比尔定律，因此不一定是线性的，但可以可靠地生成校准曲线1．然后，从单个细胞类型的校准曲线可以外推，并通过取样繁殖培养物的一部分，为定量分析细胞生长提供了基础。

材料和方法

Daudi细胞

人外周Daudi细胞来自ATCC (P/N CCL-213, Manassas, VA, USA)。RPMI培养基、非必需氨基酸(NEAAs)、胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素/谷氨酰胺(P/S/G)和DPBS缓冲液均来自Invitrogen公司(Carlsbad, CA)。Daudi细胞在添加10%胎牛血清、1倍NEAA和1倍P/S/G的RPMI中悬浮培养，每2-3天以1:10 v/v分裂一次。根据需要通过离心分离法收集细胞。用血细胞计测定细胞数量。在DPBS中进行1:2,8点串联稀释进行浊度测量。在波长为600 nm的条件下，使用Eon™微体积板分光光度计(BioTek Instruments, Inc, Winooski, VT)上Take3™Trio微体积板的微斑点对样品进行重复测量。对读取器进行控制和数据采集Gen5™数据分析软件(BioTek Instruments, Inc, Winooski, VT)。

相位对比亮场图像的2000道迪细胞在一个微斑点Take3三平板在4倍镜下拍摄。

酵母

YPD培养基粉末、氯化钠、单碱性和双碱性磷酸盐均来自Sigma-Aldrich (St. Louis MO)。YPD培养基按指示制备并经高压灭菌。酵母菌株来自w酵母实验室(Odell, OR)。隔夜培养基(50毫升)在250毫升的Erlenmeyer烧瓶中生长，温度30°C，眼眶振荡，转速125转。隔夜储备用于使用血细胞计测定细胞数量，或在YPD中创建1:2,10点的串联稀释，用于如上所述的浊度测量。

细菌细胞

大肠杆菌变种JM109从Promega (Madison, WI)获得。母株或用质粒pTRACER-CMV2转化的大肠杆菌(Invitrogen, Carlsbad, CA)在培养中按如下所述进行培养。Luria Bertani (LB)肉汤来自Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州)，按指示制备并通过高压灭菌。隔夜培养基在37°C和摇晃(5 mL)在15 mL锥形管中培养过夜。培养过夜后，用Miles和Misra法测定菌悬液中菌落形成单位(CFUs)，在LB/琼脂平板上分别接种50 μL 1:100的串联稀释液。一个1:2,8点的稀释序列从隔夜的存量生成，用于波长600 nm的浊度测量。隔夜培养也用于生长研究的培养接种。用于生长研究的培养接种使用50:1 v/v稀释LB过夜培养。以适当的时间间隔在低容量1 cm路径长度的一次性比色皿中测量培养等分，或在如上所述的配备比色管端口的Eon™微板分光光度计上使用Take3™微体积板的微斑点。

HepG2细胞

人细胞系HepG2从ATCC (P/N HB-8065)中获得。DMEM、谷氨酰胺、胎牛血清(FBS)、P/S和DPBS缓冲液来自Invitrogen公司。HepG2细胞维持在添加10%胎牛血清和1% P/S的DMEM中。通过胰蛋白酶消化获得细胞并在DPBS缓冲液中重悬。用血细胞计测定细胞数量。如上所述，在DPBS中进行1:2,8点串联稀释进行浊度测量。

结果

由于不同类型的电池衰减光的能力不同，校准曲线对于精确测定电池密度是必要的。我们使用600 nm的光密度来构建Daudi、酵母、细菌和HepG2细胞的校准曲线(图1)。我们选择用微斑中的细胞数量来表示数据Take3三平板演示精确测量所需的单元数有多少。图2显示了Take3三元板的单个微斑图像，该微斑在2 μL的体积中约有2000个道迪细胞(数据点在图1A中突出显示)。图1中的曲线可用于测定培养中各种细胞生长过程中的细胞密度。

用600 nm比浊法测量光密度的变化，得到各种细胞类型的校准曲线a)哺乳动物道迪细胞，b)酵母c)大肠杆菌菌株JM109和d) HepG2。

图1．用600 nm比浊法测量光密度的变化，得到各种细胞类型的校准曲线a)哺乳动物道迪细胞，b)酵母c)大肠杆菌菌株JM109和d) HepG2。

在Take 3 Trio平板的2毫米微光斑上有2000个道迪细胞，光密度为4 mOD。图像的深度为0.5 mm——一些细胞在焦点内，其他细胞在焦平面外。

图2．Take3 Trio平板的2毫米微光斑上有2000个道迪细胞，光密度为4 mOD。图像的深度为0.5 mm——一些细胞在焦点内，其他细胞在焦平面外。

在进行其他操作(如在细菌细胞中诱导蛋白过表达或在检测开发过程中确定最佳生长条件)之前，通常要监测细胞生长，以确保达到适当的细胞密度。JM109细胞在培养液中的生长监测方法是每隔60分钟取一个样品，持续10小时，并使用Take3 Trio微体积附件板或小体积比色皿在600 nm处读取光密度(图3)。生长曲线的叠加显示两种分析方法之间具有良好的相关性。观察了细菌细胞在培养过程中的典型生长阶段:分别在早期、中期和晚期的时间点处于滞后期、对数期和静止期。这个图展示了准确监测细菌浓度在10范围内的能力8- 109细菌细胞/mL (0.8-1.0 OD在试管中，1厘米路径长度;相当于60-70 mODTake3三平板，0.5毫米路径长度)通常与添加蛋白表达系统的诱导试剂有关。

使用a) Take3™微型体积板上的2™L样品或b)小体积比色皿中500 μL的A600每小时测量的JM109生长曲线。

图3．使用a) Take3™微型体积板上的2™L样品或b)小体积比色皿中500 μL的A600每小时测量的JM109生长曲线。

结论

浊度法是一种常用的快速细胞生长分析方法。它的灵敏度与下游应用的有用细胞密度一致。使用低至2 μL的微体积格式可以实现快速分析和样品保存。Take3三重奏与带有可选试管端口的Eon™微板分光光度计结合是一种灵活的系统，可以精确地监测多种细胞类型的细胞生长。

参考文献

  1. 托尼尼斯，G，和格兰特，DL(1949)。光度浊度和细菌浓度之间的关系。13:7-20增长。
  2. Miles, AA, Misra, SS, Irwin, JO(1938)。“对血液杀菌能力的估计。”卫生杂志38(6):732-49。

AN121911

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