监测癌细胞的细胞周期进展

用核染色法测定细胞DNA含量

作者: Paul Held，博士，BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT应用部门实验室经理

摘要

细胞周期进程是一个严格调控的过程，包括细胞核DNA内容在细胞分裂之前的复制。调节这一过程的控制机制在肿瘤细胞中经常被破坏，并成为治疗性化合物在癌症治疗中的可行靶点。细胞周期进展历史上使用流式细胞术监测。在这里，我们描述了使用microplate阅读器快速成像和分析核染色组织培养细胞的核内容。

简介

有机体的细胞周期和细胞分裂过程是一个与增殖和分化密切相关的过程。一般来说，大多数细胞是静止的，除非有信号进入细胞周期的活动段，否则不进行分裂。在一些疾病状态下(如癌症、银屑病、增生)，这种调节减弱或中断。在这些情况下，重要的是确定遗传基础，并开发治疗优先针对那些异常细胞。一种筛选潜在治疗药物或特定基因对细胞周期调节的影响的方法是使用核染色测量细胞周期动力学和DNA含量的变化。

图1所示。Cycle与DNA含量直方图的关系。随着细胞在细胞周期中的进展，它们的DNA含量在有丝分裂之前翻倍。用核染色Hoechst 33342处理的细胞显示与DNA含量成正比的荧光。

细胞周期分析的DNA含量测量是一种方法，直到最近使用流式细胞术来区分细胞周期的不同阶段的细胞。在分析之前，细胞用荧光染料对DNA进行定量染色。碘化丙啶常用于流式细胞术，因为它能被许多系统中常见的488 nm激光激发。这种染料的缺点是它也会结合RNA，因此在分析之前必须先用RNase处理细胞。核染色如4,6-二氨基-2-苯基linoloe (DAPI)或Hoechst 33342需要紫外激发，但对DNA是特异性的。无论使用什么染料，染色细胞的荧光强度都与它们所含DNA的数量相关。

当DNA含量在S相加倍时，荧光强度成比例增加。因此，处于G0和G1期(S期之前)的细胞的荧光信号是处于G2或M期的细胞的一半(图1)。在这里，我们将这些元素与基于图像的分析结合使用，而不是流式细胞术来评估细胞周期阶段状态，并识别有效阻止细胞周期进展的化合物。

材料与方法

细胞培养

PC-3细胞在添加10%胎牛血清和青霉素-链霉素的Hams F12K培养基中培养，37℃，5% CO₂．培养物常规胰酶化(0.05%胰蛋白酶- edta)，符合率为80%。在实验中，细胞被镀到康宁3904黑边透明底96孔微板中。

胸腺嘧啶双阻滞

PC-3细胞以每孔4000个细胞的密度和100 μL的体积播种到康宁3904板中，并在37°C, 5% CO的条件下过夜₂在潮湿的环境中。第二天，所有孔中均加入胸苷激酶，终浓度为2 mM。细胞处理16小时后，用新鲜培养基洗涤1次释放，然后再加入100 μL不含胸苷激酶的培养基。让细胞生长9小时后，第二次将胸腺嘧啶加入到最终浓度为2 mM的培养基中。细胞经胸腺嘧啶处理16小时后如前所述释放。盘子立即装进一个BioSpa™8系统对于细胞周期进程。

细胞周期进展

用双胸腺嘧啶阻滞同步的PC-3细胞与新鲜的完整培养基从阻滞中释放。细胞在释放后的不同时间被固定。使用BioSpa 8系统控制时间并保持必要的环境控制，用4%的PFA固定两个板的单个条，每隔1小时固定10分钟MultiFlo™外汇附属于系统。固定细胞用200 μL PBS维持至实验结束后，用10 μM Hoechst 33342染色30min, PBS冲洗3次。用PBS将细胞保持在水合状态。

药物治疗

从R&D Systems/Tocris中获得27种细胞活性剂，用DMSO重组至10 mM，保存于-80°C。用DMSO将化合物的工作存量调整到2 mM的浓度，并在-20°C保存。药物诱导当天，将化合物解冻并进一步稀释至20 μM。阴性对照(仅培养基)和阳性对照(诺可达唑、长春碱和美维诺林)也在同一培养皿中进行检测。PC-3细胞以每孔4000个细胞的密度和100 μL的体积播种到康宁3904板中，并在37°C, 5% CO的条件下过夜₂在潮湿的环境中。第二天，在3个井中加入100 μL的药物处理，使最终药物浓度为10 μL。复合暴露24小时后，细胞用PBS洗涤3次，然后用4%多聚甲醛PBS在RT中固定10分钟。固定细胞用PBS洗涤3次后，用10 μM Hoechst 33342在rt下染色30分钟，用PBS洗涤3次去除多余的染色。固定细胞和染色细胞在成像过程中保持水化，每孔用200 μL PBS。

复合滴定

在筛选试验中确定的两种化合物，就其影响PC-3细胞周期进展的能力而言，被进一步用剂量滴定法分析。在这些实验中，PC-3细胞以每孔4000个细胞的浓度(100 μL)接种，并放置过夜。第二天，在培养基中加入100 μL的复合连续滴定溶液作为2个溶液，每组8个重复。细胞暴露24小时后，细胞被固定并如前所述进行染色。

成像

每口井的蒙太奇(6 x 6)图像使用配置有DAPI LED立方体的cyation™5和10x物镜获得。DAPI立方体配置了一个377/50激励滤波器和一个447/60发射滤波器，以及一个409 nm的切向二色镜。使用Gen5™Microplate Reader和Imager Software自动设置成像参数，使用LED强度设置为5，集成时间为72 msec，增益为0。

分析

表1．核含量测定的图像处理和图像分析参数。

使用Gen5™Microplate Reader和Imager软件将图像自动拼接到单个文件中。拼接后的蒙太奇图像进行预处理，在分析前减去背景荧光(表1)。初级掩模分析识别对象的阈值为5000，下限和上限尺寸分别为5 μm和50 μm。使用Gen5软件生成总(积分)物体荧光(x轴)与%计数(y轴)之间的直方图，并将箱号设置为500。随后使用直方图图识别G1和G2细胞，并从其各自的计数峰值设置上、下信号阈值。G1和G2之间的中间区域被用来识别s期细胞。

结果

暴露于双胸腺苷块的细胞培养物在细胞周期的G1期细胞中富集。高水平的胸苷激酶的存在导致脱氧核苷酸代谢途径的中断，在G1/S边界停止细胞周期进程^[1]．如图2所示，从胸苷block释放的细胞迅速进入s期并开始复制DNA内容。这可以通过细胞荧光随时间的增加而观察到。DNA复制完成后，细胞处于G2期，荧光染色是G1期细胞的两倍。有丝分裂后，它们的核染色恢复到初始水平(图2)。

从图2中提取总荧光与物体计数的直方图用于定义G1和G2亚种群。初始(时间0)直方图显示G1和G2峰，允许使用最小和最大荧光门控值来识别这些亚种群。G1亚种群最大值和G2亚种群最小值之间的区域被用来定义s期细胞。

图2。胸苷激酶阻滞释放的PC3细胞的细胞周期进展。胸苷激酶释放后不同时间的细胞数量与荧光强度的直方图。虚线表示定义G1、S和G2/M子种群的门。

利用亚种群分析，DNA含量和周期进展之间的时间关系变得明显。如图3所示，从胸苷激酶阻滞剂中释放的细胞，其DNA含量几乎是同步的。最初，大约70%的细胞有2N个染色体。在6小时内，这个百分比下降到33%，而s期细胞的百分比从接近0增加到大约33%。此时显示4N染色体数目的细胞数量也略有增加。12小时后，大多数细胞复制了DNA含量，进入细胞周期的G2阶段。在细胞有丝分裂过程中，细胞核DNA在两个子细胞之间平均分配，使细胞回到G1期。这可以通过15小时后G2百分比的迅速下降和G1 DNA含量的细胞百分比的增加观察到，这样所有亚群都恢复到原始状态。

图3。同步PC-3细胞的细胞周期进展。与双胸腺嘧啶阻滞同步的PC-3细胞在释放后定时固定和染色。用核染色法测定G1、S和G2细胞的百分率。时间。数据点表示8个测定值的平均值。

从基于DNA含量的图像中确定细胞周期阶段可以用于筛选化合物抑制细胞周期进展的能力。基于细胞核荧光可以确定G1、S和G2期的阈值门限，用于直方图分析(图4)，使用已知的细胞周期抑制剂作为对照，以丰富这些特定细胞周期阶段的细胞群。Mevinolin已被证明能使G1期细胞停滞^[２]在G2中，诺可达唑可阻断有丝分裂，增加细胞数量^[3]．

使用这些数据来定义亚群，可以测试具有未知功效的化合物的细胞周期阻断作用。如图5所示，将PC-3细胞暴露于27种不同的化合物中24小时，计算细胞周期中处于G1、S、G2期的细胞百分比。对照孔中含有已知的化合物，可使细胞在细胞周期的G1或G2阶段停滞。这些井的截止阈值被用来定义G1、S和G2亚种群。与未处理细胞的偏差大于2个标准偏差用于识别在细胞周期的G1、S或G2阶段阻碍细胞生长的化合物。使用颜色编码标记影响PC-3进展的化合物，以快速识别细胞周期阶段。在测试的化合物中，1种化合物Mevinolin被证明能使G1细胞富集，而7种化合物引起G2细胞百分比的增加。注意，Mevinolin也被用作G1对照化合物。当它作为一种未知化合物处理时，它被独立地识别为G1中的阻塞细胞，这证实了所采用的命中标准。一些G2阳性细胞也增加了被认为处于s期的细胞的百分比。

图4。Mevinolin和Nocodazole处理PC-3细胞的核染色直方图分析。Mevinolin和Nocodazole治疗作为对照来定义G1 (RED)和G2 (BLUE)亚群。s期(GREEN)定义为G1 - G2之间的区域。

图5。96孔板中化合物的细胞周期相位屏幕的Gen5截图。PC-3细胞暴露于30种不同的化合物中，对照组为三倍。来自对照化合物的直方图用于定义亚种群分析的最小和最大荧光门。每口井都列出了G1、S和G2中细胞的百分比。不同细胞周期阶段的细胞百分比的偏差大于未处理对照孔的两个标准偏差作为截断点，以识别潜在化合物。G1相富集物以蓝色标记，G2相富集物以红色标记，S相富集物以绿色标记。

详细审查了其中一个已查明的阳性结果。PC-3细胞暴露在半对数滴定的甲氯沙明中24小时，这导致24小时暴露后G2细胞的百分比呈剂量依赖性增加(图6)。

图6。氯胺嘧啶浓度对细胞周期进程的影响。PC3细胞用不同浓度的氯胺嘧啶处理24小时。复合暴露后，细胞固定并染色核含量。利用基于图像的分析来确定细胞周期中G1、S和G2期的细胞百分比。数据点表示8个测定值的平均值。

讨论

这些数据表明，利用核染色定量核DNA含量和基于图像的分析可用于评估贴壁细胞的细胞周期进展。细胞周期分析传统上使用流式细胞术进行。虽然对淋巴细胞等非粘附细胞系很方便，但对粘附细胞系使用需要胰蛋白酶化或细胞脱皮以使其悬浮。这导致了吞吐量方面的瓶颈。使用基于图像的分析粘附细胞固定和染色到位的微板允许高通量的复合筛选。

与未处理的对照细胞相比，其中几种化合物在细胞周期的一个或多个阶段都有明显的细胞富集。以美维诺林、诺可达唑和长春碱作为试验对照来确定亚群体阈值。在这些标准下，这些相同的化合物也被正确地识别为潜在的命中分析筛选。因为暴露在单一高浓度的化合物中可能具有细胞毒性，而不一定会使细胞在任何特定的细胞周期阶段停滞，因此对潜在屏幕命中的药物滴定是必要的验证实验。

由于筛选结果表明它是一个很好的细胞周期抑制剂候选人，因此进一步研究了氯胺嘧啶。这种化合物是一种氮芥末烷化剂，通过结合和交联DNA链来防止细胞复制。因此，该药物将停止S/G2边界的细胞周期进展。使用高剂量，细胞周期进程将在s期停止，因为高度交联的DNA不能修复或复制。

Cytation™5和Gen5™Microplate Reader and Imager Software是价值和性能的理想结合。该系统能够制作多个图像以形成蒙太奇，这允许对每个样本进行更大的细胞采样。在分析之前，多个文件被缝合成一个单一的图像文件。图像预处理减去背景，消除任何井与井之间的差异之前的目标识别。对象信息的Gen5直方图分析允许研究人员直观地应用阈值门来定义G1和G2种群。快速检查多个井，然后可以用来确认适合的良好程度。然后计算和报告每个子种群的百分比。使用BioSpa系统可以进行长期活细胞实验，以保持温度、CO的环境控制₂和湿度水平。

参考文献

1. Bjursell, G.和P. Reichard(1973)胸腺嘧啶对中国仓鼠卵巢细胞中脱氧核糖核苷三磷酸库和脱氧核糖核酸合成的影响，生物学报。化学。(248(11): 3904 - 3909。
2. Held, P.(1990)论文:HMGCo A还原酶的细胞周期调控，奥尔巴尼医学院，奥尔巴尼，纽约州。
3. Zieve, G.W.， D. Turnbull, J.M. Mullins和J. R. Mcintosh(1980)使用可逆微管抑制剂诺可达唑产生大量有丝分裂哺乳动物细胞:诺可达唑积累有丝分裂细胞。实验细胞研究，126:397-405。https://doi.org/10.1016/0014 - 4827 (80) 90279 - 7