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用A260/一个280比率与光谱扫描

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2012年6月5日

作者:Peter Brescia，安捷伦科技公司

摘要

测定样品分离物中生物分子纯度的一种常用方法是使用波长为260 nm和280 nm的吸光度测量分光光度比。的一个260/一个280比率提供核酸分离物中蛋白质污染的快速指示，较少的情况下，蛋白质分离物中核酸污染的指示。此外，UV-Vis扫描可以识别分离过程中使用的化学添加剂造成的污染。在这里，我们使用安捷伦BioTek来评估微体积分析的能力2022世界杯附加赛决赛Take3microvolume盘子。

简介

分光光度法分析生物分子的样品定量和纯度评估已经有很好的文献。核酸和蛋白质中所含的发色团吸收紫外线使定量成为可能。与这些方法一致的是使用比尔-朗伯定律，该定律将分子吸收的光的物理性质与样品内的浓度联系起来，公式如下:

方程:

其中ε是分析物的摩尔吸收系数或消光系数，l是路径长度(cm)， c是分析物的浓度。dsDNA的平均消光系数= 0.020 (ng/μL)-1cm-1;RNA = 0.027 (ng/μL)-1cm-1，蛋白质= 0.001 (ng/μL)-1cm-1。传统的紫外-可见分光光度法使用标准通道长度为1 cm的容器进行测量，简化了计算，其中a /ε=c。但分离样品浓度高，1 cm血管通路长，定量前需进行样品稀释，给定量过程带来了困难。这一稀释步骤可以通过路径长度的显著缩短来避免，这产生了微体积分析，通常在路径长度降低一个数量级以上时进行。当然，比尔-兰伯特定律仍然适用于这些较低路径长度的分析，允许在不稀释样品的情况下进行精确定量1．

核酸样品纯度的评估通常通过一种通常称为a260/一个280比率是指在这些确定的波长上进行的两次分光光度测量。对于双链DNA，公认的260 nm和280 nm处的平均消光系数分别为0.020和0.010 (ng/μL)-1cm-1;蛋白质在260 nm和280 nm处的消光系数平均值分别为0.00057和0.001 (ng/μL)-1cm-1。因此，很明显，核酸样品在260纳米处的吸光度比在280纳米处的吸光度高，而对于蛋白质样品则相反。使用这些消光系数，纯核酸样本会得到A260/一个280比例为2.0，而蛋白质为0.57。含有蛋白质和DNA混合物的样品当然会受到这两种大分子的影响。根据比尔-朗伯定律，溶液的总吸光度是组成溶液的各组分吸光度的和，因此，对于核酸和蛋白质的混合物，成立如下式:

equation2

请注意，由于采用的是吸光度的比值，如果使用同一容器进行两次测量，则路径长度变量将被抵消。

在某些情况下，可以通过对样品进行光谱分析来获得额外的信息。通常情况下，生物分子在波长220到300 nm之间以1 nm的增量进行扫描。覆盖这一范围的光谱将确保捕获生物分子的吸收剖面以及任何潜在污染物的吸收剖面，如果它们在这一波长范围内具有显著的吸光度的话。因此，光谱分析可以提供一种相对快速的检测污染物存在而不破坏样品的方法。

本应用说明展示了使用微体积容器与几个不同的微板阅读器相结合的能力，以定量微升体积的生物分子。还介绍了分子生物学技术中常用的检测污染物的能力。

材料与方法

双链DNA (dsDNA)样本的制备采用鲱鱼精子dsDNA(部分编号D6898)，该精子dsDNA购自Sigma-Aldrich公司(St. Louis, MO)，重悬于TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0)缓冲液中。蛋白样品使用从Sigma-Aldrich公司购买的牛血清白蛋白(BSA)(零件号A3294)制备，并在MilliQ水中重新悬浮。所描述的浓度是基于0.5 mm或1 cm路径长度和50µg/mL/OD的DNA和0.667 mg/mL/OD的BSA蛋白。

双链DNA光谱扫描测量使用安捷伦BioTek Synergy H4混合多模微板阅读器、安捷伦BioTek Epoch微板分光光度计或安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek Eon微板分光光度计结合安捷伦BioTek Take3微体积板，其标称路径长度为0.5 mm，或比标准分光光度试管典型的1 cm路径长度小20倍。用dsDNA原液(70 ng/µL)进行5点1:2稀释串联。样品空白分别由2 μ L的TE或MilliQ水组成，用于dsDNA或蛋白质。通过在每个波长使用适当的溶剂预读Take3板并从样品测量值中减去样品来去除样品。用实验室擦拭法将空白从Take3中去除，并使用手动移液器将每种生物分子浓度的重复样品加载到Take3板上。

为了比较纯生物分子样品与异质样品，使用dsDNA (100 ng/µL)和BSA (625 ng/uL)的原液制备dsDNA、蛋白质和异质样品。利用上述消光系数，分别从260或280 nm处dsDNA和BSA的峰值吸光度与每种成分的预期浓度的测定结果进行比较，计算出每种物种的百分比准确度。

用于苯酚和盐酸胍痕量污染分析的样品是使用随着污染物浓度增加而添加的dsDNA (2000 ng/µL)。

结果与讨论

图1是一系列dsDNA浓度在6.5 ~ 67.5 ng/µL之间的图。复合光谱分析表明，在~260 nm的波长处有一个吸收峰，这通常与高度纯化的dsDNA有关，而这与dsDNA浓度的增加有关。这个峰值在低ng/ L浓度下是可识别的，可以与质量消光系数一起使用，以计算样品中DNA的浓度。

微体积光谱扫描分析。利用Synergy H4和Take3微体积板，在TE缓冲液中对重复的2 μL dsDNA样品进行光谱扫描微体积分析。

图1所示。微体积光谱扫描分析。利用安捷伦BioTek Synergy H4混合多模微板阅读器和安捷伦BioTek Take3微体积板，对TE缓冲液中复制的2µL dsDNA样品进行光谱扫描微体积分析。2022世界杯附加赛决赛这些数据表明，在低ng/µL范围内，样品具有进行微体积谱分析的能力。(值表示归一化为0.5 mm路径长度的空白数据)。

在生物分子分离过程中共同净化的常见污染物通常是生物来源的，如DNA的蛋白质污染或反之亦然。样品的光谱分析可以通过训练有素的眼睛与已知标准的光谱进行比较。dsDNA、蛋白质和1:10 DNA/蛋白质的复杂混合物(w/w)的标准在230 ~ 290 nm进行光谱扫描进行分析(图2)。虽然这些光谱是为了在分析纯化或复杂样品时清楚地展示可能会看到的差异，但结果光谱可能不会显示构成样品的分子的明显差异。

生物分子光谱数据比较。纯化的dsDNA、BSA蛋白和含有1:10 DNA/蛋白(w/w)的复杂混合物的典型吸光度谱。

图2．生物分子光谱数据比较。纯化的dsDNA、BSA蛋白和含有1:10 DNA/蛋白(w/w)的复杂混合物的典型吸光度谱。样品的光谱分析在从230 nm到290 nm的1 nm增量下进行。数据归一化为1厘米的路径长度。

计算光谱分析的两个或两个以上波长的比值提供了一种快速的方法，以确定污染物是否可能存在于生物分子样本(如DNA)中。在较宽的DNA/蛋白质样品浓度比范围内，可以在260 nm处的光谱中观察到显著的浓度依赖性差异，而在280 nm处观察到的变化相对较小(图3)280一些样品的比例曲线显示纯化的dsDNA在260 nm处和纯化的蛋白质在280 nm处的预期谱峰(图4)260/一个280纯化的DNA和蛋白质的比值分别为1.8和0.6。然而，虽然有显著的浓度依赖性的变化260和一个280当样品组分的比例发生变化时，需要相当多的蛋白质污染才能在A中反映出来260/一个280比率(图5)。

纯化的dsDNA、蛋白质或混合物的吸收光谱扫描。样品包含纯化的鲱鱼精子dsDNA、BSA蛋白或DNA/蛋白混合物，比例不同(w/w)。测量间隔为1 nm，波长为220 ~ 300 nm。数据归一化为1厘米的路径长度。

图3。纯化的dsDNA、蛋白质或混合物的吸收光谱扫描。样品包含纯化的鲱鱼精子dsDNA、BSA蛋白或DNA/蛋白混合物，比例不同(w/w)。测量间隔为1 nm，波长为220 ~ 300 nm。数据归一化为1厘米的路径长度。

典型的与生物分子样品相关的A280比率。样品含有纯化的dsDNA、蛋白质或DNA/蛋白质混合物(60%/40%)(w/w)。测量波长为240 ~ 290 nm，间隔为1 nm。

图4．典型的一个280与生物分子样品相关的比率。样品含有纯化的dsDNA、蛋白质或DNA/蛋白质混合物(60%/40%)(w/w)。测量波长为240 ~ 290 nm，间隔为1 nm。然后通过将每个波长测量值除以A来计算A280比率280每个样品的测量。数据归一化到1 cm。

A260/A280比值与DNA蛋白质污染增加有关。样品中含有纯化的鲱鱼精子dsDNA, BSA浓度在40-100% (w/w)范围内不断增加。测量在260到280纳米。然后计算每个DNA/蛋白质混合物的A260/ A280比值。数据已归一化到1厘米。

图5。一个260/一个280与DNA蛋白质污染增加相关的比例。样品中含有纯化的鲱鱼精子dsDNA, BSA浓度在40-100% (w/w)范围内不断增加。测量在260到280纳米。的一个260/一个280然后计算每个DNA/蛋白质混合物的比例。数据已归一化到1厘米。

当从异质样品的吸光度测量中计算生物分子浓度时，可能会出现相当大的不准确性(表1)。同样，这种影响在含有低水平DNA污染的蛋白质样品中最为显著，而低水平蛋白质的DNA污染的影响会导致相对较小的不准确性。最主要的问题是，如果样品中含有干扰分子，在下游加工过程中可能会出现并发症。由于必要的反应组分的定量不准确或底物抑制，污染物会导致催化效率低下等影响。

表1。从光谱数据计算的百分比精度测定:DNA/蛋白质。DNA和蛋白质浓度的准确性分别通过260和280的峰值吸光度测量来计算。DNA和蛋白质的消光系数分别为50 ng/µL/OD和0.667 g/µL/OD，用于计算测定值与预测值的比较，并以准确度百分比表示。

从光谱数据计算的百分比精度测定:DNA/蛋白质。DNA和蛋白质浓度的准确性

虽然竞争物种对生物分子的污染是一个主要挑战，但加工过程中的其他污染物也可能存在。酒精、酚和盐等污染物是纯化和操纵DNA和蛋白质的试剂包中常见的残留成分。由于相似的吸光度曲线和重叠的光谱峰，许多污染物会干扰纯化的生物分子的精确定量。在纯化核酸时，保证样品完整性的一种常用方法是用变性剂处理源样品，以去除普遍存在的核酸酶活性。在样品制备过程中，通常将原液浓度为8 M的盐酸胍(GuHCl)添加到裂解或均质缓冲液中。残留的微量GuHCl(<1.0%)会影响DNA的定量，这是因为在约260 nm处的光谱吸收峰明显下降(图6和表2)。这可能是由于试剂的混沌效应导致DNA部分变性，且似乎与浓度无关。

DNA光谱分析:古盐酸污染。随着盐酸胍浓度的增加，鲱鱼精子dsDNA的光谱分析。数据已归一化为1厘米的路径长度。

图6。DNA光谱分析:古盐酸污染。随着盐酸胍浓度的增加，鲱鱼精子dsDNA的光谱分析。数据已归一化为1厘米的路径长度。

表2。从光谱数据计算DNA浓度:古盐酸污染。DNA浓度是用A260在规定浓度的污染物存在时，消光系数为50 ng/μL/OD。

从光谱数据计算DNA浓度:古盐酸污染。

苯酚是分子生物学中用于分离DNA、RNA和蛋白质的常用试剂的第二个例子。这种方法通常被称为苯酚-氯仿萃取法，它依赖于水饱和苯酚与氯仿的1:1比例。核酸的沉淀通常在提取之后进行，以去除残留的苯酚。图7和表3显示，即使痕量的残留苯酚低至0.2% (v/v)，也会显著影响DNA的精确定量。

DNA光谱分析:酚污染。随着苯酚浓度的增加，鲱鱼精子dsDNA的光谱分析。

图7。DNA光谱分析:酚污染。随着苯酚浓度的增加，鲱鱼精子dsDNA的光谱分析。数据归一化为1厘米的路径长度。

表3．从光谱数据计算DNA浓度:苯酚污染。DNA浓度是用A260在规定浓度的污染物存在时，消光系数为50 ng/μL/OD。

从光谱数据计算DNA浓度:苯酚污染。

结论

该分析强调了用分光光度法在低至2µL的样品体积中测定分析物浓度和纯度的能力。此外，还提供了对小体积样品进行吸收光谱扫描的能力的例子。通过与高纯度样品的光谱比较，该光谱数据可用于生物分子分离方法中常见残留污染物的检测。而A260/一个280在了解了测定样品纯度的比例之后，重要的是要认识到依赖A的局限性260/一个280比率作为唯一的验证手段。有几种辅助方法可以帮助验证分析物的纯度，包括凝胶电泳、质谱和高效液相色谱(HPLC)，当准确性对下游应用至关重要时，应该考虑这些方法。

参考

  1. 布雷西亚,p;利用Epoch/Take3分光光度计系统进行核酸多体积分析，BioTek仪器有限公司应用说明，2009年。

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