用光谱扫描分析在标准微版阅读器中测定贴标效率

作者: Peter J. Brescia，应用科学家，BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT

各种方法和试剂已被开发来有效地标记生物分子。这些标签与现代分析技术和仪器相结合，极大地提高了分析灵敏度。许多这种标记方法涉及到蛋白质或核酸的共价修饰，从而通过柔性连接子增加荧光团或功能部分。在各种实验方法中使用标记试剂，如免疫荧光、TR-FRET和ELISA，已被证明在高通量环境下允许样品和试剂保存的同时，可以显著提高检测灵敏度。在这里，我们描述了在microplate阅读器中使用微体积光谱扫描分析生物素或地高辛标记的蛋白质抗体偶联物。

简介

分光光度法分析在生物科学中已经广泛应用了几十年，用于检测和定量各种物质。常用的生物样品分析方法主要有吸收法、荧光法和发光法。此外，这些方法依赖于一个相对狭窄的带宽范围，从紫外可见到近红外光谱区域，波长在~200-999 nm范围内。许多分子具有可以用分光光度法直接分析的固有性质。然而，遇到复杂的实验条件，导致直接分析目标分析物所需的光谱区域的信号干扰，从而导致信号噪声较差的情况并不少见。因此，已经开发了各种各样的标记化学物质，可以帮助减少背景干扰，同时增加检测灵敏度和动态范围。

一种常见的分析方法是夹心免疫分析，包括通过固定在固体载体上的抗体捕获目标分析物，如微孔板表面;与典型的桥接型免疫分析法一样。捕获之后，使用被标记抗体对被分析物的不同表位进行检测。常见的标签是地高辛或生物素。

在检测开发过程中，可能需要对商业上无法获得的所需形式的特殊蛋白质进行定制标记。高效的标签和产品的量化是确保下游应用成功的关键。已经开发了几种商业上可用的产品来简化标记效率。乐鱼平台入口在这里，我们描述了抗体标记的方法，以及随后产品产量和标记效率的量化，需要使用检测抗药物抗体(ADA)的模型系统来验证免疫原性试验，它可能存在于血清样本中，对抗生物药物。ADA检测方法需要用地高辛或生物素部分标记感兴趣的生物。Solulink公司(San Diego, CA)提供的试剂包含有助于标记产品的标记和量化的特性，通过合并常见的连接剂化学和uv可追踪的发色团，以计算每个分子的标签数量(图1)。分子替代比(MSR)，即抗体的每个分子的标签比例，可以在检测开发过程中经过经验验证后用作鉴定指标。

MSR比率通常为2-8。通过测量标记试剂的可追溯双芳腙发色团对波长为280 nm的紫外光的吸收和对波长为354 nm的光的吸收来计算MSR。测量数据可以通过使用Take3™微体积板和标准吸光度微板阅读器对低至2 μL的样品进行光谱扫描来收集。

图1所示。ChromaLink标记试剂。加入紫外线可追踪的双芳基氢化带发色团可以快速定量标签的加入，而长链PEG3间隔剂有助于生物素/链亲和素动力学的保留，并增加在水溶液中的溶解度。A) ChromaLink地高辛和B) ChromaLink生物素。

材料与方法

两种不同的药物抗体标记反应被用于上面描述的分析格式。对于AlphaLISA®ADA试验，药物抗体生物素化是使用ChromaLink生物素试剂(Solulink, Inc.， San Diego, CA, USA)按照制造商的推荐并使用标准纯化程序进行的。对于基于溶液的ELISA ADA检测，药物抗体地高辛使用ChromaLink地高辛一次性抗体标记试剂盒(Solulink, Inc.， San Diego, CA, USA)进行。简单地说，在标记之前，使用Amicon®Ultra-0.5离心过滤装置(具有100K名义分子量极限(NMWL)截止)对药物抗体进行浓缩以满足标记要求，并使用ZebaTM Desalt自旋柱将其交换到适当的修饰缓冲液中(100 mM磷酸钠，150 mM氯化钠，生物素pH 7.4, 130 mM磷酸钠，地高辛标记pH 8.0)。

生物素标记，0.05 mg药物抗体与DMF中制备的nhs - chromalink -生物素以30:1摩尔比孵育。用改性缓冲液完成反应，总体积为100 μL，室温~23℃孵育2小时。产品的纯化使用Zeba进行^TM脱盐纺丝柱与磷酸盐缓冲盐水(PBS)预平衡，纺丝至干燥。

用于光谱扫描的井首先在280和354 nm处用消隐缓冲液PBS进行吸光度测量，用于光谱扫描后的背景减去计算。对260-380 nm的每个样品进行吸光度光谱扫描，以1 nm的增量，使用2 μL的样品Take3™微型体积板阅读Epoch™微板分光光度计(BioTek仪器公司，Winooski, VT, USA)。数据收集使用Gen5数据分析软件(BioTek仪器公司，Winooski, VT, USA)。根据制造商的协议，使用Solulink (http://www.solulink.com/ library#calcs)提供的适当的Kit Calculator计算产品的生物素化比率，并分别在354 nm和280 nm处减去吸光度读数，以确定MSR和产品回收率。

用地高辛进行标记，如上文所述，并进行以下修改。用适当的修饰缓冲液在100 μL的体积中将药物抗体浓度调整为1 mg/mL。ChromaLink^TM在装试剂的小瓶中加入5 μL DMF制备地高辛标记试剂。将全体积的药物抗体(100 μL @ 1 mg/mL)加入试剂瓶中搅拌，室温~23℃孵育60分钟，用10 μL的1 M Tris, pH 8.9猝灭反应。淬火反应在1500 x g离心30秒，并添加到Zeba^TM用如上所述的PBS预平衡去盐自旋柱进行净化。产品分析如上所述，以确定MSR和产品回收率定量。

结果与讨论

我们进行了几个药物抗体标记实验，然后使用2 μL回收产物进行微体积吸光度光谱扫描分析(图2)。通过在280 nm处的吸光度定量测定，回收率通常≥起始样品的80%。产品损失可能是由于Zeba柱树脂残留滞留造成的，回收体积一般约为90 μL。MSR取决于反应中抗体质量、反应缓冲液、孵育时间和反应化学计量等因素。当按照标准方法使用15倍摩尔当量的连接剂进行标记反应时，典型的MSR范围为每个目标分子2-8个标记。生物素和地高辛标记的MSR分别为3.34 ~ 6.84和2.07 ~ 3.1;完全在预期范围内。样品在分析后从Take3™微井中回收，最大限度地减少了分析过程中的样品损失。

图2。微体积光谱扫描分析。用2 μL产品对药物抗体标记效率进行标记后分析。数据以1 nm的增量从260到380 nm收集，一式两份。A)地高辛标记的药物抗体和B)生物素标记的药物抗体(代表性数据)。

结论

通过使用一种带有UV可追溯标签的商用标记试剂，可以很容易地实现高效标记用于检测开发的专门生物试剂的能力。对一种用于免疫原性抗药物抗体测定的药物抗体进行生物素和地高辛标记，并使用微量吸收光谱扫描分析进行量化。典型的回收量约90 μL，通过SDS-PAGE分析确定为纯的(数据未显示)。重复测量2 μL样品，占样品的4-5%进行MSR分析。由于可回收的标签产品数量有限，执行容许样品回收的微体积分析的能力是重要的。重复数据显示了良好的重现性，导致回收率、标记效率和相关MSR值与期望值一致。

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