监测细菌在不同环境条件下的生长

使用安捷伦BioTe2022世界杯附加赛决赛k LogPhase 600提供高质量的动力学数据

作者: Paul Held，博士，安捷伦技术公司，I,nc。

摘要

微生物，如细菌，在现代生活的许多不同方面起着关键作用。它们被用于医疗产品的生产、环境修复、生物医学研究和食品生产，这里仅举几个不同的用途。乐鱼平台入口操纵和选择具有特定特性的不同菌株的能力对它们的效用至关重要。同样，新菌株的发展往往需要监测菌株在各种条件下的生长。这里描述的是安捷伦BioTek的使用2022世界杯附加赛决赛LogPhase 600微生物学阅读器提供温度控制，悬浮液搅拌，并在96孔微板中使用光散射监测细菌生长。

简介

细菌在利用其天然能力的许多方面在工业中发挥着关键作用。它们被用于食品制造和抗生素、益生菌、药物、疫苗、发酵剂、杀虫剂、酶、燃料和溶剂的生产。在食品工业中，乳酸菌等乳酸菌，Lactococcus,链球菌用于生产乳制品，如奶酪和酸奶。乐鱼平台入口乳酸菌和醋酸菌用于橄榄、酸菜和酸菜等产品的腌制过程，而细菌发酵则用于酱油的加工。在制药工业中，细菌被用来生产抗生素、疫苗和医用酶。利用细菌代谢特定污染物可以加强土壤和废物的修复。

为了优化它们的效率，选择了在特定环境条件下生长的菌株。作为筛选具有这些属性的细菌的一种手段，将菌株在各种实验条件下悬浮液中生长，找出生长速率最高的菌株。悬浮培养中细菌的生长可以用浊度或光散射测量来监测。随着细胞数量的增加，溶液变得越来越浑浊，因为穿过溶液的光被存在的微生物散射了。¹在不服从比尔定律的情况下，随着光散射的增加，到达探测器的总光束的百分比减小，并记录为吸光度。

在悬浮液中生长的细菌会随着时间的推移而增加。如果用吸光度监测光散射，则观察到一条s型曲线(图1)。初始接种后，细菌数量相当少，存在的细菌正在适应新的环境。这一阶段被称为滞后阶段，表明光密度(OD)的变化非常小。对数期生长加速，细菌数量显著增加，OD变化迅速。当营养变得稀缺和废物积累，生长放缓和培养进入静止阶段。乐鱼平台入口

的LogPhase 600微生物学阅读器执行动力学OD₆₀₀测定，同时提供温度控制和摇动多达4个独立的96孔微板。相关的软件应用程序提供了一个简单的用户界面来输入读取参数。在运行完成时，应用程序还提供了测定指标，如滞后期的长度、最大生长速率和达到最大光密度的时间。阅读器使用微板的能力，以评估大量的实验条件在一个小的标准化足迹。同时容纳四个96孔微板的能力进一步增加了实验的可能性。

图1．典型的细菌动力学生长曲线。

材料与方法

培养基粉末、干粉和乙醇来自Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州)。直接制备LB和2XYT肉汤培养基，用高压灭菌法灭菌。LB培养基为10 g色氨酸、5 g酵母提取物、5 g NaCl / l, 2XYT培养基为16 g色氨酸、10 g酵母提取物、5 g NaCl / l。无菌平底透明微板(零件号3598)，来自康宁(Corning, NY)。光学清晰的TopSeal-A板封口机，目录号6005185，来自PerkinElmer (Boston, MA)。JM109株大肠杆菌来自Life Technologies (Carlsbad, CA)。

所有的实验都遵循相同的一般格式。隔夜培养基(50毫升)在250毫升的Erlenmeyer烧瓶中生长，37°C，眼眶摇动200转/分钟。在进行生长实验之前，用新鲜培养基将细菌培养物稀释至1:500。然后根据需要将稀释的细胞镀至康宁3598平底透明板中，总容积为150 μ L。使用Agilent BioTek LogPhase 600微生物仪，在37°C下，每2.5 - 10分钟进行一次测量(800转/分钟)。2022世界杯附加赛决赛使用Agilent BioTek微生物生长应用程序控制阅读器并收集数据。2022世界杯附加赛决赛

所有实验都要求用实验化合物取代孔中的一部分生长介质，微孔的最终体积始终为150 μ L。除非另有说明，实验添加物需在水中稀释。在每次实验中，所有的样品都将培养基均匀稀释以进行比较。

结果与讨论

培养基配方的比较
初步测试了两种不同的常用培养基配方的生长特性。如图2所示，两种配方在使用未稀释时提供显著的和几乎等价的生长曲线。而2XYT能够成长大肠杆菌在密度和生长速率稍高的情况下，相对于配方的差异差异不大。

图2。的比较大肠杆菌在LB和2XYT培养基配方中的生长。在96孔的微孔板上接种大肠杆菌，每5分钟动态监测吸光度，持续12小时。数据代表了8口井的平均值。

由于几次实验将需要对培养基进行一定程度的稀释以达到实验目的，两种配方均按不同比例用水稀释。在这些条件下，2XYT在较低的浓度下提供了接近最佳的生长速率(图3)。这并不出乎意料，因为与LB培养基相比，该配方在每体积中使用了更多相同的成分。所有进一步的实验都使用2XYT介质。

图3。年增长率大肠杆菌用不同浓度的细菌培养基。LB和2XYT培养基用水稀释后接种大肠杆菌以及动态监测的生长。每口井的最大生长速率被确定并绘制为生长介质浓度的函数。数据表示8种测定方法的平均值和标准差。

NaCl水平对生长速率的影响

为了检验NaCl对细菌生长的影响，将2XYT培养基的一部分替换为水中稀释的NaCl。如图4所示，环境盐度的增加会降低大肠杆菌。在非常高浓度的情况下，细菌几乎不会生长。

图4。年增长率大肠杆菌用不同浓度的细菌培养基。LB和2XYT培养基用水稀释后接种大肠杆菌，动态监测其生长。每口井的最大生长速率被确定并绘制为生长介质浓度的函数。数据表示8种测定方法的平均值和标准差。

pH值的影响
环境的pH值对细菌的生长有深远的影响。使用大范围缓冲系统来保持pH值从2.5到12.3。用缓冲液代替部分生长培养基，并在孔中接种大肠杆菌．如图5所示，pH值低于5.5时几乎没有生长。随着pH值的升高，生长速率迅速增加，在pH值7.5时生长速率最大。当pH值增加到7.5以上时，生长速率降低，当pH值为12时，生长速率约为最大值的60%(图5)。

图5．培养基pH值对细菌生长的影响。稀释液100 μL大肠杆菌将2XYT培养基的培养物添加到含有50 μL通用缓冲液的不同pH值的微板孔中。动态监测生长12小时，最大生长率作为ph值的函数绘制。数据表示8种测定的平均值和标准差。

图6．不同糖分子存在下细菌生长的比较。2XYT培养基中添加100µM的指示糖接种大肠杆菌并且对生长进行动态监测。柱状图表示8种测定方法的平均值和标准差。

由葡萄糖和果糖单糖组成的双糖蔗糖，在生长速度上没有同样的提高。这表明该菌株缺乏有效分裂两种单糖之间的糖苷连接的能力，或者能量消耗相当于葡萄糖的释放所带来的增益。肌醇是肾脏葡萄糖代谢的副产物，当加入时，会导致生长速度下降大肠杆菌文化。

一些非糖碳水化合物分子也被用来补充大肠杆菌文化。有趣的是，与对照井相比，添加50 μ M的三碳分子丙酮酸盐导致最大生长速率增加38%(图7)。乙酸盐，两碳分子，导致26%的下降，而柠檬酸盐在类似浓度下完全停止生长。这些生长速率的变化并不是由于添加这些弱有机酸引起的pH的变化，因为培养物中也含有50 mM Hepes (pH 7.5)作为一种手段来缓解pH作为变量的影响。

图7．存在小碳分子时细菌生长速率的比较。接种2XYT培养基，添加50 μ M指示分子和50 mM Hepes (pH 7.5)大肠杆菌并且对生长进行动态监测。柱状图表示8种测定方法的平均值和标准差。

添加溶剂对生长速率的抑制作用
溶剂的存在会影响细菌的生长。如图8所示，生物系统中常用的几种溶剂的增加会对生长速率产生显著影响。四氢呋喃的浓度超过0.5%可以消除细菌生长，而DMSO的浓度为5%则可以容忍。有趣的是，与未处理的对照组相比，低浓度的DMSO增加了生长速率。

图8．溶剂对细菌生长的影响。在2XYT培养基中加入不同浓度的四种常用溶剂大肠杆菌监控活动。计算每个孔的最大生长速率，并绘制为溶剂浓度的函数。每个数据点代表八个测定值的平均值和标准差。

这些数据证明了LogPhase 600微生物学阅读器使用光散射作为定量生长速率的手段来表征菌株的实用性。使用JM109菌株大肠杆菌研究了几种不同培养基添加剂对细菌生长的影响。它们作为在实验条件下使用LogPhase 600测试细菌生长的概念证明的例子。

选择在规定条件下生长的菌株用于许多不同的场景。例如，土壤修复通常使用可以利用特定污染物作为能源的细菌。拥有长期工业遗产的地区形成了棕地。棕地通常含有石油碳氢化合物、持久性有机污染物，如多氯联苯和有毒金属。识别出能够代谢这些化合物并将其作为碳源的特定细菌，有可能减轻它们的一些毒性。理想情况下，所使用的菌株应具有:(a)降解目标污染物的优越能力;(b)容易培养;(c)提供快速增长;(d)对高浓度污染物有耐受能力;以及(e)在各种环境条件/压力源下生存的能力。⁴要鉴别出最符合这些标准的细菌，就需要对许多种细菌进行测试。

结论

安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek LogPhase 600微生物学阅读器是进行这类实验的理想平台。与其他传统的微孔板阅读器不同，LogPhase 600阅读器能够同时容纳4个96孔板。因为在实验期间，所有四个平板都包含在相同的读取器环境中，可以进行多达384个数据点的真实比较。阅读器提供温度控制从30°到45°C，在1°增量，结合轨道震动。该读卡器的设计从地面开始，以连续震动，与强大的平衡机构，以减少噪音和振动。摇动速度可以从500到800转或关闭，如果有必要。LED光源提供波长特定的光终生不需要更换灯。无需干预即可编程进行长达72小时的检测。在长时间的运行中，如果有必要，可以暂时中断测试，然后重新启动而不丢失数据完整性。

一个专门的软件应用程序被用来建立分析。使用该应用程序，培养温度，分析持续时间，读取间隔，和摇动速度设置。在下入过程中，会显示代表每口井的小图标。鼠标点击任何一口井都可以放大外径₆₀₀情节。如果需要，可以叠加几个图进行比较。在运行完成时，计算滞后时间、最大生长速率和到达最大外径的时间。如果需要进一步的数据分析，原始和计算数据可以很容易地导出为Excel或文本文件。

参考文献

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2. Stubbings, W.J, Bostock, J.M, Ingham, E.和Chopra, I.(2004)评估微板法测定抗生素后对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的影响，《抗菌化学杂志》54(1):139-143。
3. Brooke, D, N. moved, and B. Bother(2015)用于生物化学和生物物理实验的通用缓冲，2(3):336-242 DOI:10.3934/ biphysi.2015.3.336。
4. Megharaj, M.和R. Naidu(2017)微生物生物技术:1244-1249。