用于生物库的核酸样本分析的低容量、高通量工作流程

作者:小彼得·布雷西亚、克里斯·威尔逊和彼得·班克斯安捷伦科技有限公司

核酸的准确定量仍然是执行测序、诱变和qPCR等下游过程之前的关键步骤。最常用的分析方法是荧光法和分光光度法，前者用于要求高灵敏度的应用;后者用于纯度的定量。这些分析方法从核酸提取过程中产生更大的体积和更高浓度的样品。定量通常在试管或基于微板的格式中进行。越来越多的人对样品保存和高通量分析感兴趣，这些分析更适合微微板格式，因为它能够分析更小的体积，增加样品容量，并结合自动化。

简介

核酸为所有生物提供遗传信息，从植物和动物到细菌和病毒。在许多情况下，在测序、用于分子克隆的限制性内切酶消化、连接、PCR和qPCR等下游过程之前，对纯化的RNA和DNA样品进行表征是很重要的。

荧光法和分光光度法都是核酸定量的常规方法。前者用于要求高灵敏度的应用，而后者更传统地用于纯度分析和常见核酸纯化方法的产量。核酸定量通常在比色管分光光度计中进行，其中基于单色器的光学系统提供260 nm的光(核酸的最大吸光度)。越来越多的研究人员正在使用微孔板分光光度计，以取代比色皿为基础的仪器，以提高通量和样品保存。

背景

生物分子吸收紫外线(UV)光，这与样品中存在的分子浓度直接相关。核酸样品常规在230 nm、260 nm、280 nm等不同波长的光下进行分析，其中260 nm和280 nm分别为核酸和蛋白质的吸收峰，如图1所示。

此外，在230 nm处的测量可用于评估从样品中提取核酸后的残留污染物。较低的260/230比例可以表明萃取过程中残留的苯酚和/或胍污染。图2展示了增加苯酚量对dsDNA光谱扫描的影响。注意在230 nm处对苯酚污染物的吸光度显著提高。

图1所示。DNA、RNA和蛋白质的典型吸收光谱，核酸的峰值约为260 nm，蛋白质的峰值约为280 nm。

表1。基于A₂₆₀/一个₂₈₀比率。注意，不同形式的核酸并不能用这个比例来区分。

图2．随着苯酚浓度的增加，鲱鱼精子dsDNA的光谱分析。数据规范化为1厘米的路径长度。

基于比色管的分光光度计使用水平光路，其中特定波长的光聚焦于垂直于容器。血管通常有一个固定的路径长度为1厘米，尽管有各种固定路径长度可用。相比之下，微孔板分光计测量微孔板井中的样品，使用随样品体积变化的垂直路径长度(图3)。

图3。固定1厘米路径长度的比较使用垂直定向试管系统和可变垂直光路的微皿系统。路径长度依赖于样品体积和微孔板尺寸。

虽然以比色皿为基础的测量提供了简单、精确的测定，但通量仅限于单个样品测量，更高浓度的样品必须稀释，并且需要更大的样品体积。相比之下，微孔板分光光度计，在某些情况下，微体积系统，为最终用户提供了增加的样品通量自由稀释，并要求显著更小的样品体积，同时保持精度和准确性。

按照惯例，核酸的消光系数是基于1厘米径长测量的(表2)。因此，在微孔板分光光度计中，样品的径长取决于微孔板孔中的体积，为了正确地量化样品，有必要将吸光度测量修正为等效的1厘米径长。

表2。普遍接受的消光系数。*基于1cm的路径长度。

核酸计算基于比尔-兰伯特定律，公式如下:

A = εcl

样品的吸光度(A)可以由样品的消光系数(ε)和浓度(c)以及被测量样品的厚度(路径长度)(l)的乘积来确定。

Gen5™数据分析软件有内置的，自动的方法，以确定路径长度的样品稀释在水缓冲液。Gen5使用水在室温(977 nm)的吸光度峰值和900 nm的背景测量。977 nm - 900 nm的光密度差除以0.18，表示水在1厘米处的光密度。上述计算的结果是样品的路径长度，然后可以用来准确地确定微孔板中核酸的浓度。Gen5软件在定义的实验协议中提供以下自动化数据分析步骤:

1.测量溶液在977nm - 900nm处的OD值，并除以1cm处已知的水的OD值:

一个₉₇₇——一个₉₀₀样品/ 0.18 OD =样品径长(cm)

2.在260 nm处测量样品，减去空白，除以路径长度:

一个₂₆₀样本- A₂₆₀空白/样本路径长度= OD修正为1厘米

3.样品孔中DNA浓度的计算:将校正后的OD值乘以相应的消光系数:

OD校正至1cm * 50 =孔内DNA浓度(μg/mL)

随着准确的核酸定量，在下游应用之前确定样品的纯度是很重要的。与萃取过程有关的蛋白质和其他污染物，如苯酚和盐，可能会干扰准确的吸光度读数，使结果扭曲。核酸纯度是通过计算260 nm处的核酸峰吸光度与280 nm和230 nm处的测量值的比值来估计的。为了校正背景，可以在~320 nm处进行测量;因为蛋白质和核酸不吸收这个波长。背景减法和比率计算可以自动与Gen5软件。

虽然用于定量溶液中核酸的紫外吸收方法可以提供关于其总体丰度和纯度的信息，但不可能辨别样品中DNA和RNA的相对丰度。由于检测和准确量化DNA对于一系列下游应用非常重要，因此通常采用更精确和更具歧视性的方法。PicoGreen是一种非常敏感的不对称菁染料，可用于dsDNA定量。未结合的染料没有内在荧光，但与dsDNA结合后，染料荧光强烈，最大发射约530 nm。它比紫外吸收法灵敏度高10000倍，对dsDNA的选择性高于ssDNA和RNA(图4)。

图4。PicoGreen染料与dsDNA结合后的荧光增强

dsDNA标准曲线的使用允许通过测量样品的荧光发射和从标准曲线插值来精确定量未知样品。这种方法提供了样品中dsDNA的精确估计。使用荧光决定因子的多路复用吸光度表征方法可以提供样品质量的测量，以及使用384孔微孔板格式的高通量方法准确量化dsDNA的能力。

材料与方法

PicoGreen dsDNA试剂盒，目录号P-7589，是Life Technologies (Grand Island, NY)的礼物。UV-Star®，μClear®，黑色，384孔微孔板，目录号788876，是Greiner Bio-One北美公司(Monroe, NC)赠送的礼物。96孔UV透明板是康宁公司(图克斯伯里，马萨诸塞州)的礼物。在TE缓冲液中制备鲱鱼精子dsDNA (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)的储备液，并将其分配到比色皿和/或微孔板中，以便根据需要进行定量。数据采集使用Synergy™Neo2多模式酶标仪(BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT)或PharmaSpec分光光度计(Shimadzu America, Inc.， Columbia, MD)。采用Gen5数据分析软件协同Neo2仪器控制，数据收集和分析。数据还导出到Excel (Microsoft, Inc.， Redmond, CA)进行进一步分析。UVProbe软件用于PharmaSpec仪器控制和数据采集。数据从UVProbe以ASCII格式导出，并导入Microsoft Excel进行分析。

结果

微板中核酸的自动定量已经进行了几十年。然而，这里提出的挑战是使用低容量微板开发更高通量的dsDNA小型化分析。选用Greiner Bio-One公司的UV-Star®、μClear®、384孔微孔板。该板底部透明，黑壁，不含可检测的DNase, RNase和人类DNA。高密度和浅孔特征(最大体积为20 μL)提供了显著减少分析体积的能力，同时保持足够的路径长度以进行精确和精确的dsDNA测量。

为了确定在UV-Star®、μClear®、384孔微孔板中进行精确光密度测量所需的最小体积，在重复孔中进行1:3连续稀释10 mg/ mL dsDNA，并以2或4 μL移液。表3展示了Gen5从OD测量中计算出的dsDNA浓度以及精度数据。

表3。使用Synergy Neo2和Greiner Bio-One UV-Star®、μClear®、384孔微孔板测定2和4 μL总体积下的dsDNA浓度和精度。

2 μL总体积下的路径长度为0.6 mm;4 μL时为1.2 mm。从表3的精度数据可以明显看出，由于路径长度的增加，使用4 μL可以显著提高精度。这种改进后的精度可与96孔微孔板中更大的样品体积测定相媲美，[dsDNA]约为1.5 μg/mL。

图5。核酸样本高通量分析工作流程图。

在确定了分析所需的最小样本量后，进行了一系列实验来验证该方法。建立dsDNA稀释系列，并通过比色皿和UV-Star®、μClear®、384孔微孔板进行直接比较。

用Shimadzu Pharmaspec的试管对dsDNA进行质量评估，结果显示A₂₆₀/一个₂₈₀和一个₂₆₀/一个₂₃₀在大多数稀释系列中，A . A .的比例是一致的，并满足纯核酸的普遍接受值(表4)₂₆₀/一个₂₈₀比率下降到指示纯样品的通常相关值以下(~1.8);稀释核酸样品的常见观察。

表4．生物银行应用的典型浓度。

使用Synergy™Neo2在Greiner UV-Star®、μClear®、384孔微孔板中以4 μL体积定量相同的稀释系列。稀释高浓度核酸作为必要的比较，微体积决定因素。对Synergy Neo2上生成的数据进行消隐和路径长度校正，得到与纯核酸一致的比值(表4)₂₆₀/一个₂₃₀和一个₂₆₀/一个₂₈₀比值(图6)表明，在核酸提取方法制备的样品的典型浓度范围内(~50 ~ 1000 μg/mL)，高纯度dsDNA的可接受值。

图6。代表一个₂₆₀/一个₂₃₀和一个₂₆₀/一个₂₈₀比率来自Synergy Neo2上使用4 μl样品在Greiner UV-Star®、μClear®、384孔微孔板上收集的数据。

A的准确性₂₆₀4 μL dsDNA样品的浓度决定因子与试管决定因子进行比较。从表4所示的典型dsDNA制备样品的工作范围来看，核酸决定因素的百分比准确度在-12.3%至2.6%之间。

表5所示。使用Synergy Neo多模式微孔板阅读器从4uL dsDNA样品中获得PicoGreen荧光，随后进行吸光度测量和试剂添加。

在提出的工作流程中，通过荧光强度准确估计dsDNA浓度是基于PicoGreen染料与dsDNA的选择性结合。对384孔微板中的dsDNA进行紫外/可见分析后，所有孔均加入20 μL PicoGreen工作试剂。随后对平板进行分析发现，在样品浓度的典型工作范围内，存在>~ 60000 RFU的动态范围。此外，方差系数(CV’s)较低，范围为~0.9%至6%(表5)，表明重复测量之间具有良好的相关性。原始RFU数据图表明在典型工作范围内具有良好的线性(图7)。

图7。使用BioTek的Synergy Neo2多模式微板阅读器绘制dsDNA浓度与原始RFU的对比图。

结论

上述数据表明，将384孔板中dsDNA的紫外/可见吸收质量评估和荧光(PicoGreen)定量相结合的多重工作流程是提高dsDNA制剂定量和质量控制的可行解决方案。结果表明，在50 ~ 150 μg/mL核酸的典型收率范围内，4 μL样品的质量和数量均可分析，符合典型的质量控制要求。此外，鉴于试剂使用量减少，上述工作流程将实现额外的成本节约，以及在生物银行设施等大样本量分析时节省大量时间。

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