培养的人ipsc衍生肝细胞的长期肝毒性研究

作者:布拉德·拉尔森和彼得·班克斯安捷伦科技公司;科比·卡尔森和迈克尔·汉考克，国际细胞动力学；有酒味的Luty,恩佐生命科学

摘要

定量显微镜被用来确定药物对聚集成球形的人iPSC衍生的肝细胞的影响。用荧光探针测量了三种表型毒性:活性氧产生、线粒体膜电位下降和质膜破裂。结果与在平底微板中培养的肝细胞进行比较。球体的形成使动力学研究得以进行更长时间，长达14天。这种能力允许测量完整的药理学和表型。

简介

药物性肝损伤(DILI)，或处方药或非处方药引起的肝脏损伤，继续是一个日益严重的公共卫生问题，也是药物开发的一个挑战。这些影响可能是急性的，也可能是慢性的，而且随着膳食补充剂、草药或非传统疗法市场的不断增长，这些影响变得更加复杂。大多数DILI是对特定药物的意外反应，或在标准肝毒性试验中未见的长期慢性损伤的结果。

为了测试新药实体是否存在潜在的DILI，在活的有机体内模特仍然是黄金标准。然而，这些研究是昂贵的，耗时的，更重要的是，由于主要是小鼠肝细胞的合并，对人类毒性的预测能力较差。因此,在体外使用原代肝细胞的筛查成本较低，减少动物接触，更适合于更高通量的平台。然而，个体间的高变异、有限的批次大小、细胞形态的变化以及长期培养过程中的肝脏特异性功能等限制都对该模型提出了挑战。相比之下，人诱导多能干细胞(iPSC)肝细胞是一种很有前途的肝细胞在体外可选性是因为它们表现出初级组织样表型，高水平的一致性和无限的可用性。

在进行毒性研究时，肝细胞在多日内被反复给予不同浓度的潜在药物，以评估任何累积效应。当结合原代肝细胞的二维(2D)细胞培养时，这提出了特殊的挑战，因为当以这种方式培养时，细胞会迅速去分化并失去代谢活性。三维(3D)细胞培养模型可以使细胞聚集并保留已发现的功能和通信网络在活的有机体内．3D培养模型创造的良好环境允许进行长期给药实验，从而更准确地评估药物的累积效应。

本应用说明证明了3D培养的人ipsc来源的肝细胞用于肝毒性研究的适用性。肝细胞球状体暴露于DILI I类或III类三种药物的多浓度:托斯卡酮、对乙酰氨基酚和丝分裂霉素c，在短期和长期暴露于药物后，基于三种表型对肝细胞健康进行直接基于图像的评估。这些表型包括产生活性氧(ROS)，这表明氧化应激，线粒体膜电位(MMP)下降，这是凋亡级联的早期触发，质膜(PM)破裂，这是坏死细胞死亡的迹象。我们还对2D培养的ipsc衍生肝细胞进行了比较。

材料与方法

材料

细胞

iCell肝细胞2.0(部件号PHC-100-020-001)由细胞动力学国际公司(Madison, WI)捐赠。这些细胞是人类ipsc衍生的肝细胞，具有典型的肝脏功能和表型稳定性。由于其人类起源，原生细胞样行为，和易于使用，iCell肝细胞2.0代表了在药物开发、疾病建模和毒理学所有领域的基础肝生物学的最佳测试系统。

分析和实验成分

BioCoat i型胶原蛋白涂层24-(零件号354408)和384孔板(零件号354667)由康宁生命科学(Corning, NY)捐赠。GravityTRAP ULA 96孔板(零件号ISP-09-001)从PerkinElmer (Waltham, MA)购买。对乙酰氨基酚(部件编号1706)、丝裂霉素C(部件编号3258)和托尔卡酮(部件编号5864)从研发系统公司(明尼阿波利斯，MN)购买。ROS- id总ROS/超氧化物检测试剂盒(零件号ENZ-51010)、MITO-ID膜电位检测试剂盒(零件号ENZ-51018)和核id蓝/红细胞活性试剂(GFP认证)(零件号ENZ-53005)由Enzo生命科学公司(Farmingdale, NY)捐赠。

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Cytation 5是一种模块化多模微板阅读器，与自动化数字显微镜相结合。基于滤镜和单色仪的微板读数可用，显微镜模块提供高达60倍放大的荧光，亮场，彩色亮场和相位对比。该仪器可以在一个步骤中进行多达四个通道的荧光成像。Cytation 5特别强调活细胞分析，温度控制在65°C, CO₂/ O₂气体控制，以及用于动力学分析的双注射器。z叠加和投影也可以用于支持3D细胞生物学。集成的安捷伦BioTek Ge2022世界杯附加赛决赛n5微板阅读器和成像仪软件用于控制成像仪和自动双掩模分析。

方法

细胞培养制剂

iCell肝细胞2.0根据制造商的协议进行解冻和培养。更多细节和媒体信息请参见CDI用户指南。用于三维球体形成的细胞首先以60万个细胞/孔的浓度播种到24孔胶原蛋白包被板中。保留用于2D细胞培养的细胞以3万细胞/孔的浓度添加到384孔胶原包被板上。所有的培养皿在37ºC/5% CO中孵育₂，每24小时交换一次媒体。5天后，24孔板中的细胞被分离并以2000个细胞/孔的浓度播种到GravityTRAP板中，以允许球体的形成(通常在48小时后完成)。384孔板中的培养基继续每天更换，直到解冻后的第7天添加化合物。

肝毒性测定程序

在球形形成后，采用1:2连续稀释法制备已知肝毒素对乙酰氨基酚(5000 ~ 0 μM)、丝裂霉素C (10 ~ 0 μM)和托尔卡酮(200 ~ 0 μM)的10点滴定。这些浓度范围反映了用于治疗的常用剂量。从所有测试板井中取出废培养基，用新鲜培养基和复合滴定法代替。水井每隔48小时重新注入新化合物。

测定细胞健康的时间点为二维镀肝细胞1天和7天，三维球形细胞1天、7天和14天。测定方法包括:

• ROS- id总ROS/超氧化物检测试剂盒产生ROS，该试剂盒主要由两种荧光染料组成:氧化应激检测试剂(绿色)为总ROS检测试剂，超氧化物检测试剂(橙色)为超氧化物检测试剂。
• 线粒体膜电位(MMP)使用MITO-ID下降，这是一种阳离子染料，根据膜电位状态发出绿色或橙色荧光。与MMP下降相关的橙色荧光减少表明细胞凋亡的早期阶段。
• 使用NUCLEAR-ID进行PM破裂，这是一种用于活细胞成像的蓝色荧光细胞透性核酸染料和用于染死细胞核的红色荧光细胞透性核酸染料的混合物。

检测流程从培养基去除开始，接着更换含有来自复用ROS-ID和NUCLEAR-ID或MITO-ID和NUCLEAR-ID荧光显微镜套件的探针的培养基，并在37°C/5% CO中孵育5小时₂．然后用PBS清洗孔，以去除未结合的探针，然后使用Agilent BioTek Cytation 5在PBS中进行基于图像的检测。2022世界杯附加赛决赛一个10倍物镜用于2D细胞成像，一个4倍物镜用于3D细胞成像。

来自所有多路荧光探针的信号通过以下成像通道在单个成像步骤中捕获:

• ROS-ID/NUCLEAR-ID多重检测- DAPI通道:核标识活细胞探针;
  德州红色频道:核识别死亡细胞探针;
  RFP频道:ROS-ID超氧化物探针
• MITO-ID/NUCLEAR-ID多重检测- DAPI通道:核id活细胞探针;
  德州红色频道:核识别死亡细胞探针;
  GFP频道:MITO-ID膜电位探针胞质单体;
  RFP频道:MITO-ID线粒体聚集物

结果与讨论

二维肝毒性试验

在评估一种药物或其代谢物引起DILI的可能性时，通常不仅要检查其诱导明显细胞死亡的能力，而且还要确定所观察到的肝毒性的原因。除了作为凋亡活性早期指标的线粒体膜电位(MMP)的损失外，两种常用的机制包括氧化应激诱导和ROS生成。使用基于荧光显微镜的探针测定了二维镀iCell肝细胞的短期和长期治疗后，对乙酰氨基酚、丝分裂霉素C和托卡彭诱导氧化应激和凋亡的能力，从而导致下游坏死(图1)。与之前报道的对乙酰氨基酚毒性机制1一致，这些多重荧光分析能够检测暴露于高剂量对乙酰氨基酚后的药物诱导肝毒性效应。增加对乙酰氨基酚浓度和重复给药导致检测到ROS形成(图1A至1C)，与凋亡相关的线粒体膜电位丧失(图1D至1F)，最终细胞膜完整性丧失和坏死细胞死亡(图1G至1I)。

图1所示。二维镀iCell肝细胞2.0图像，表达对乙酰氨基酚治疗后的细胞窘迫表型。使用10倍物镜拍摄的图像。顶部行:ROS- id探针检测到ROS生成为橙色斑点增加，而核id染色的活细胞为蓝色或死细胞为粉红色/红色。(一)低;(B)对乙酰氨基酚暴露一天后产生中间ROS;(C)对乙酰氨基酚治疗7天后ROS水平高(625 μ M)。中间行:MMP下降可见为橙色聚集物的丢失，同时由于MMP降低，由MITO-ID试剂检测到较小的聚集绿色染色细胞增加。用核id探针染色细胞，使活细胞染成蓝色，死细胞染成粉红色/红色。(D)控制线粒体膜电位稳定的细胞群。(E)部分和(F)完全失去橙色线粒体聚集物，表明所有细胞在接触扑热氨基酚1天和7天后MMP受损(625 μ M)。 Bottom row: PM rupture indicated by a loss of green cytosolic staining using the green-fluorescent MITO-ID probe along with an increase in pink/red stained dead cells versus blue live cells via NUCLEAR-ID. (G) Low amount of PM rupture following one-day exposure versus (H) high amount of cells with PM rupture following seven days of acetaminophen exposure (625 µM). (I) Loss of cell attachment after seven days of treatment with 5 mM acetaminophen.

二维肝细胞定量图像分析

使用Gen5™的细胞分析特征和表1-3所示的参数，对所有复合处理和潜伏期进行了超氧化物表达、诱导凋亡和诱导坏死活性的量化。

表1。二维超氧化物表达细胞分析参数。

表2。2D细胞凋亡活性分析参数。

表3。2D坏死活性细胞分析参数。

对于超氧化物表达和凋亡活性，在Hoechst 33342染色的细胞核周围放置初级掩膜(图2A)。然后在目标探头超过设定阈值的区域周围放置二级掩模(图2B)。

对于坏死活性，再次在核ID蓝/红细胞活性试剂的活细胞探针染色的细胞核周围放置初级掩膜(图2C)。由于活细胞和死细胞探针都定位于细胞核，来自死细胞探针的荧光也在初级掩膜内进行分析(图2D)。

最后，设置亚群体标准，以识别对复合处理有统计学响应的细胞(阳性响应细胞)。表4描述了具体计算的细胞分析指标和亚群体标准，用于识别复合处理中表现出三种不同表型效应的细胞。以百分比表示的对总细胞的响应比例，表明每种复合处理对孔内肝细胞的影响(图3)。

图2．2D肝毒性一级和二级物体面罩放置。添加MITO-ID超氧化物探针后未处理的肝细胞显示(A)主要核对象掩膜和(B)目标探针信号周围的次要对象掩膜。肝细胞暴露于acetaminophen 7天(625 μM)后显示(C)使用来自NUCLEAR-ID活细胞探针的信号放置初级掩膜，(D)初级掩膜内的死细胞探针信号。

表4。2D阳性反应细胞标准。

图3．2D肝毒性结果。(A)计算出的EC₅₀值。(B)复合剂量响应曲线。

非处方止痛药对乙酰氨基酚和帕金森病药物托尔卡彭在24小时的治疗后，以类似的方式显示了ROS生成和MMP下降的表型。低剂量处理7天后，这些表型的表达明显增加。然而，PM破裂在治疗7天后才显著明显。与其他药物相比，化疗药物丝裂霉素C表现出相对温和的表型反应，特别是在仅治疗一天后。然而，仍可诱导二维镀金肝细胞的长期毒性反应。

三维肝毒性试验

对乙酰氨基酚、丝裂霉素C和托卡酮的毒性作用也在3D培养的iCell肝细胞2.0球体中进行了检测(图4)。在暴露于每种化合物1、7和14天后，评估了相同的三种表型。

与二维镀片肝细胞成像相似，从聚集成三维球体的肝细胞中也可以检测到目标探针的信号。通过在多个z平面上收集图像，然后为包含堆栈中焦点部分最多的每个成像通道投影最终图像，对复合处理的影响进行了精确分析。

肝细胞三维球形z投影图像分析

ROS生成、MMP下降和PM破裂水平的计算方法与二维镀肝细胞相似。为了在使用3D球体图像时进行最佳计算，需要适当调整Gen5细胞分析参数(表5至7)。

图4。．iCell肝细胞2.0球形图像，表达对乙酰氨基酚治疗后细胞窘迫表型。使用4倍物镜拍摄的图像。顶部面板:ROS- id探头检测到ROS生成为在球体内增加的橙色信号。(一)低;(B)中间;(C)对乙酰氨基酚治疗14天后ROS水平高。中间图:MMP下降显示为球状体内橙色信号的丢失，而MITO-ID试剂检测到保持一致的绿色信号。(D)控制表现稳定MMP的细胞群。(E)部分; and (F) complete loss of orange mitochondrial aggregates following fourteen days of acetaminophen treatment. Bottom panel: PM rupture was indicated by an increase in pink/red stained dead cells within the spheroid versus blue live cells via NUCLEAR-ID. (G) Untreated hepatocyte spheroid; (H) intermediate; (I) high amounts of PM rupture following fourteen-day acetaminophen treatment.

表5．3D超氧化物表达细胞分析参数。

通过调整主要分析标准，如物体尺寸的最小和最大，主要掩模作为单个物体放置在整个球体周围(图5A)。然后将二级掩膜放置在目标荧光探针信号周围，这些信号来自球体内满足阈值标准的所有细胞，表明细胞对复合处理有反应(图5B)。二级掩模覆盖面积除以整个球体面积的百分比表示响应细胞的比例(图5C和5D)。

分析投影的三维图像、剂量响应曲线和生成的EC₅₀值(分别为图5A、5B、5C和5D)表明，与二维被沉积的肝细胞相比，肝毒素具有最小的短期效果和右移的3D药理学。图像还显示球形肝细胞的诱导坏死不会引起大规模的细胞损失。3D培养的这一特性可以更准确地生成长期肝毒性结果。最后，利用三维肝细胞模型进行扩展复合治疗的能力，允许阐明在二维中不可能实现的潜在作用机制。这可以从长达14天的丝裂霉素C治疗诱导的ROS生成中看出(图5C)。

表6．3D细胞凋亡活性分析参数

表7所示。三维坏死活性细胞分析参数。

图5．三维肝毒性结果。一级核物体掩模，二级物体掩模周围(A)低;和(B)高目标探测信号。(C)复合剂量响应曲线。(D)计算出二维和三维肝细胞的EC50值。

结论

ipsc衍生的人肝细胞的3D球形培养，如iCell肝细胞2.0，提供了一个相关的细胞模型进行长期培养在体外肝毒性测试，同时加入荧光探针允许定量细胞毒性表型在2D和3D细胞模型。此外，安捷伦BioTek Cytation 5细胞成像多模式读取器和安捷伦BioTek Gen52022世界杯附加赛决赛微板读取器和成像软件的优化功能提供了集成细胞模型和荧光探针的自动化、可靠的成像和分析。适当的细胞模型、检测方法、成像和分析的结合创造了确定测试分子潜在的慢性肝毒性作用的最佳方法。

参考

1.Hinson,正当;罗伯茨,D.W.;对乙酰氨基酚诱导的肝坏死机制。中国药理学杂志，2010，(6)，369- 476。