GPCR依赖的第二信使系统的活细胞成像

使用安捷伦BioTe2022世界杯附加赛决赛k Cytation 3细胞成像多模式阅读器实时成像基因编码的GPCR反应传感器

作者: Paul Held博士，Peter Banks博士，Agilent Technologies, Inc;保罗·图森，安妮·玛丽·奎恩，还有蒙大拿州分子乐队的汤姆·休斯

摘要

相当一部分学术和药物发现研究致力于阐明由g蛋白偶联受体(GPCRs)及其配体之间的相互作用引起的第二信使信号级联。由于细胞信号传导涉及多个第二信使通路的相互作用，能够同时检测这些通路的不同组成部分的多路传感器在推进生物医学研究方面特别有益。本应用说明描述了安捷伦BioTek Cytation 3的使用，这是一种高成本效益的组合细胞成2022世界杯附加赛决赛像仪和微板阅读器，用于快速成像和分析基因编码的荧光生物传感器到许多GPCR相关的第二信使。

简介

细胞信号包括一个综合的，多方面的系列第二信使系统，其作用一致，将细胞表面受体介导的信号传递到各种各样的细胞内过程。GPCRs是细胞信号级联最显著的启动物，也是许多药物发现工作的目标。化合物文库的药物发现筛选依赖于对大量样品进行快速测定的能力。同时，表型信息也需要评估真实的细胞反应。为此，具有多个传感器的系统能够同时检测GPCR途径的不同信号成分是特别重要的。

GPCR与其配体相互作用产生的信号级联是多方面和复杂的。涉及G蛋白偶联受体的信号转导途径有两种:cAMP信号途径和磷脂酰肌醇信号途径。¹活化的受体催化其异三聚体g蛋白的活化和解离。

在cAMP通路中，活化的g α亚基刺激跨膜糖蛋白腺苷酸环化酶。腺苷酸环化酶，Mg存在时^{2 +}或锰^{2 +}辅助因子，催化ATP向cAMP的转化。cAMP然后作为细胞代谢中的第二信使，是蛋白激酶a (PKA)的变构激活剂，PKA是一种由调节亚基二聚体组成的全酶，每个都与催化亚基结合(图1)。

图1所示。g蛋白偶联受体(GPCR)信号通路示意图

在低水平cAMP下，全酶保持完整且无活性。当cAMP浓度上升时，cAMP与调节亚基结合，导致催化亚基的释放，使它们能够磷酸化丝氨酸或苏氨酸残基上的多种蛋白质。¹在磷脂酰肌醇途径中，Gαq亚基激活磷脂酶C (PLC)，其裂解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP₂)生成二酰基甘油(DAG)和肌醇1,4,5-三磷酸(IP_3.)．IP_3.触发钙的释放(Ca^{2 +})来自细胞内储存，以及细胞内Ca^{2 +}DAG激活常规蛋白激酶C酶，具有大量下游靶点(图1)。由于多条信号通路能够产生DAG、PIP水平升高₂或Ca^{2 +}多重传感器对于明确检测GPCR信号是必要的。

基于基因编码荧光蛋白的传感器已被开发用于评估GPCR信号的多个第二信使。最新一代的这些传感器使用单一的圆形排列荧光蛋白，将分析物结合转化为荧光强度的变化(向上或向下)。^3.例如，DAG探针具有位于蛋白激酶C (PKC)亚型PKCδ伪底物和C1结构域之间的圆形排列荧光蛋白部分。^3.由于C1结构域对DAG具有很高的亲和力，因此DAG结合引起的任何构象变化都紧密地位于荧光蛋白上。⁴晶体结构分析表明，分析物与活性元素的结合导致荧光变化，这是由于在发色团附近的β-桶结构中打开和关闭一个孔的结果。⁵利用该技术，开发了一系列针对GPCR信号通路多个组分的传感器。⁶

Cytation 3是一种细胞成像多模式阅读器，包含多个光路。Cytation 3既可以作为多模式阅读器使用基于pmt的全孔检测，也可以作为基于ccd的数字倒置显微镜在亮场或荧光模式下工作。四个独立的LED光立方位置可以使用2.5倍、4倍、10倍、20倍、40倍和60倍显微镜物镜进行多个不同的荧光成像，其中任何两个都可以同时出现在阅读器中。一个可选的双注射器分配器用于添加试剂。读卡器内部的分配器尖端有一个20°角，这使得流体有足够的力量来提供适当的混合，同时避免损伤细胞单层。

材料与方法

细胞培养

HEK293T细胞在添加10%胎牛血清和青霉素-链霉素的Eagle 's最低必需培养基(EMEM)中培养，37℃，5% CO₂．培养常规胰酶(0.05%胰蛋白酶- edta) 80%合流。转染时，在100 μL的培养基中以每孔25000个细胞的密度进行转染。

细胞转染

对于每个转染(即96孔板的单孔)，在Opti-MEM中将140 ng质粒DNA (100 ng传感器DNA和40 ng受体)稀释至25µL。此外，用Opti-MEM将0.42 μ L的脂质体稀释至25 μ L，将两种溶液混合并添加到细胞中。细胞与此混合物孵育4至6小时，并用新鲜培养基替换混合物和生长培养基。让细胞在成像前生长24 - 48小时(图2)。在成像前，立即用1x Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(DPBS)替换生长培养基。

图2。GPCR途径分析前的分析过程。细胞被播种到玻璃或塑料底板上，用感兴趣的受体和传感器瞬时转染。转染细胞在转染后24至48小时实验使用，以允许引入的遗传元件充分表达。

成像

转染的培养物使用配置有4x和20x目标的Cytation 3和GFP和德州红光立方体成像。该成像仪使用LED光源结合带通滤波器和二向色镜来提供适当波长的光。GFP光立方使用469/35激励滤波器和525/39发射滤波器，而德州红光立方使用586/15激励滤波器和647/57发射滤波器。

图像分析

使用Agilent BioTek Gen5数据分析软件分析数字图像数据的平均荧光强度和靶细胞计数。2022世界杯附加赛决赛第5代定义了连续的区域或区域，这些区域由指定的阈值强度值以及最小和最大规模限制所概括。这些区域被计算为“对象”或“单元格”。然后使用传统的数据约简来绘制基于图像的值。

结果与讨论

协同GPCR受体和磷脂酶C (PLC)激活使用绿色和红色荧光传感器对DAG, PIP2, cAMP和Ca2+进行多重评估。在特定分析物存在的情况下，测试了许多能够产生较大“向上”或较小“向下”荧光量的传感器。

细胞物计数图像分析评估卡巴醇对HEK293T细胞的影响。使用Green向下DAG和R-GECO Ca2+探针，在添加卡巴醇前后对细胞进行动力学成像。使用Agilent BioTek Gen5图像分析软件确定达到预定的绿色和红色荧光阈值的细胞数量并绘制。2022世界杯附加赛决赛在加入卡巴醇之前，两种颜色中高于阈值的细胞数量保持不变。在添加刺激后，超过绿色阈值的细胞数量下降超过30%，而大于红色阈值的细胞数量增加50%(图3)。

图3。绿色向下DAG和R-GECO传感器荧光。HEK293T细胞共转染Green向下DAG6和R-GECO7传感器，使用绿色荧光蛋白和德州红光立方体，Agilent BioTek Cytation 3细胞成像多模式阅读器在4倍和20倍处进行动态成像。2022世界杯附加赛决赛每个4倍图像中阳性细胞的细胞数量的变化被绘制成两种颜色的时间曲线。黑色箭头表示添加了卡巴醇。绿色和红色的细胞图像之前和之后加卡巴醇显示。白色箭头表示受刺激后荧光有明显变化的细胞。

使用绿色向上和红色向下传感器进行了类似的基于图像的cAMP实验。通过卡巴醇刺激细胞，可以观察到绿色和红色20倍图像的平均荧光信号有显著的折叠变化(向上和向下)(图4)。折叠变化用于适应转染效率的差异。

当使用单元对象计数分析时，使用较低放大倍率(4倍)图像获得的更大的视场通常更优越，如图5所示。在卡巴醇刺激后不久，由于钙离子浓度的影响，绿色荧光的强度明显增大。这可以通过阈值细胞计数分析进行量化，在刺激后25秒内，超过阈值的细胞数量增加了一倍以上，在300秒内恢复到正常水平。

图4．绿色向上cAMP和红色向下cAMP传感器荧光。转染(A)绿色向上cAMP或(B)红色向下cAMP传感器的HEK293T细胞分别使用GFP和德克萨斯红光立方体在20倍处进行动态成像，并分别与Cytation 3结合。在每个图像的荧光平均的折叠变化是对两种颜色的时间绘制。黑色箭头表示加入异丙肾上腺素。显示加入异丙肾上腺素前后细胞的绿色和红色图像。白色箭头表示受刺激后荧光有明显变化的细胞。

图5。G-GECO Ca⁺⁺传感器。G-GECO Ca转染HEK293T细胞的钙通量⁺⁺传感器⁷通过Agilent BioTek Cytation 3成像动态监测卡巴醇和绿色荧光。2022世界杯附加赛决赛Agilent BioTek Gen5软件自动细胞分析确定2022世界杯附加赛决赛绿色阳性细胞的细胞计数。图像在指定的时间点也提出。

多探针分析使用两个探针都增加荧光显示在图6中。当被卡巴醇刺激时，用green向上DAG和R-GECO Ca传感器共转染的HEK293T细胞可以观察到红色和绿色荧光的增加。两种颜色都可以用相同的单元格成像和分析。2022世界杯附加赛决赛Agilent BioTek Gen5图像分析程序确定了平均荧光，并将其绘制为时间的函数。刺激前后的叠加图像显示颜色强度明显增加。

图6。绿色向上DAG和R-GECO Ca⁺⁺传感器的荧光。HEK293T细胞共转染Green向上DAG和R-GECO Ca⁺⁺传感器在20x处使用GFP和带有Cytation 3的德州红光立方体进行动态成像。在每个图像的荧光平均的折叠变化是对两种颜色的时间绘制。箭头所示为卡巴醇的添加。显示了添加卡巴醇前后细胞的绿色和红色重叠图像。白色箭头表示受刺激后荧光有明显变化的细胞。

使用Green向上DAG和R-GECO Ca测试了该技术的重复性^{2 +}传感器。用卡巴醇刺激HEK293T细胞的多个孔，随着时间的推移，监测绿色或红色荧光阳性细胞数量的变化(图7)。如前所述，在刺激之前，荧光增加的细胞数量几乎为零，而受体刺激之后，大量细胞呈绿色或红色荧光阳性。这一观察结果在许多井中都是可重复的。如图7所示，多孔图显示荧光变化程度相同，荧光变化时间相同。有趣的是，在这些细胞中，钙的反应始终快于DAG的反应。

图7。．GPCR传感器的重复性。同时转染Green向上DAG和R-GECO Ca传感器的HEK293T细胞被卡巴醇刺激(箭头)。多孔细胞在刺激前后成像。对图像进行细胞分析，以确定绿色和红色信号阳性的细胞。数据表示阳性细胞数较初始读数的变化。

实验传感器与对照荧光蛋白结合的使用如图8所示。在这些实验中，与绿色向上DAG和RFP对照共转染的细胞显示，刺激后绿色阳性细胞数量增加，而阳性红细胞计数没有任何明显变化。向HEK293T细胞中添加卡巴可导致绿色荧光迅速增加，荧光水平在添加刺激后125秒内恢复到基线水平。刺激前后捕获的图像进一步说明了这一点，显示在所指示的细胞中绿色荧光强度显著增加，而相同的细胞中红色荧光几乎没有变化。

对PIP2敏感的传感器也已开发出具有类似灵敏度的传感器。如图9所示，经红色向下PIP2传感器转染的HEK293细胞在卡巴醇刺激后红色荧光明显下降。当绘制细胞数量的百分比变化时，观察到显示红色荧光的细胞数量迅速减少。与其他向下作用的传感器一样，响应时间比向上作用的传感器稍慢。

这项研究已经证明了使用组合微孔板阅读器和成像仪来检测第二信使水平的变化，使用一系列基因编码荧光传感器。新型二酰基甘油(DAG)基因编码生物传感器₂磷脂、钙^{2 +}，和环磷酸腺苷(cAMP)改变荧光响应分析物浓度的变化，并可在单个活细胞试验中复用。^3、6、7这种读取器/成像仪和生物传感器的组合具有在活细胞中进行快速分析测定以及表型成像的能力。

Cytation 3有许多功能，使活细胞成像。四个独立的LED位置允许使用多个不同的放大显微镜物镜进行多重荧光成像，其中任何两个可以同时出现在阅读器中。Gen5软件是其他安捷伦BioTek微板阅读器常见的软件，已经2022世界杯附加赛决赛过增强，可提供微板中细胞的自动聚焦，使用自动或用户自定义参数(LED强度、CCD增益、集成时间等)捕获图像，以及允许细胞分割和细胞计数的细胞分析算法。可选气体控制器(CO₂和O₂)和内置的温度控制，允许长期研究和时间推移视频。

图8。绿色向上DAG传感器与RFP控制的共表达。同时转染Green向上DAG和对照RFP的HEK293T细胞用卡巴醇刺激(箭头)。使用4倍或20倍物镜对细胞随时间进行成像。对4x图像进行细胞分析，以确定绿色细胞阳性。相似时间点的20倍图像描绘了典型的荧光图像。白色箭头表示随时间荧光变化明显的细胞。

图9。红色向下PIP的定量₂传感器的响应。HEK293T细胞转染Red向下PIP₂用卡巴醇刺激传感器(箭头)。细胞随时间推移使用4x成像。对4x图像进行细胞分析，以确定红色阳性细胞。细胞数量变化百分比被绘制成随时间变化的图。

用于控制读取器功能的Gen5软件还能够进行重要的自动图像分析。图像分析可用于计算满足阈值和大小标准的细胞数量。如本应用笔记所示，绿色或红色荧光阳性的细胞比例在响应卡巴醇刺激的GPCRs时发生变化。

这种新一代的活细胞荧光传感器在响应刺激时产生巨大的荧光变化。这些传感器是基于单个荧光蛋白进行基因编码的，不需要添加任何其他试剂或细胞裂解，这使得它们非常适合多路复用。传感器有多种颜色可供选择(红色和绿色)，以及向上和向下荧光信号变化版本。这种组合提供了许多不同的实验选项。单个传感器可以单独使用，也可以与不变荧光蛋白联合使用，作为评估转染效率的内部控制。或者，可以同时使用两个不同的传感器来绘制信号级联中不同产品的响应，从而提高分析的可靠性和性能。乐鱼平台入口

这些传感器的进一步开发将能够更完整地解释GPCR信号。添加其他荧光蛋白，在不同波长荧光将增加进一步的多重能力。创建构成性地表达基因编码细胞系和受体的细胞系，不仅可以减少实验准备时间和工作量，而且还可以减少由差异转染效率引起的井间差异。Imager和软件与众多基因编码传感器的结合将使新的基于gpcr的分析方法的开发变得容易。

参考文献

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资金

这项工作部分由美国国家科学基金会资助。基因编码传感器DAG, PIP₂cAMP由NSF SBIR 1248138、NIH SBIRs R43MH096670和R44NS082222开发。蒙大拿州SBIR配对基金(12-50-RC sir -006)授予蒙大拿州分子。