用三维球体模型测定活细胞缺氧

基于ppm的全井检测与基于图像的细胞分析的比较

作者: Brad Larson和Peter Banks，应用部门，BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT;Wini Luty,恩佐生命科学，法明代尔，纽约州

简介

与生物化学方法相比，基于细胞的分析方法提供了丰富的药物筛选信息，而且成本和时间仅为传统动物模型的一小部分。据估计，现在为目标验证和ADME-Tox执行的筛选中有一半包含了基于单元格的格式1。向活细胞格式的进化提供了有价值的数据，这些数据可能在单个时间点，即裂解分析中丢失。除了更深入地了解细胞力学和细胞在检测过程中仍然完好无损的反应外，活细胞分析通过动力学或多路复用分析提供了更大的灵活性。这两种检测方法的一个缺点是，在固体扁平基质上生长的细胞不能表现出与在体内生长的细胞相同的形态和行为方式¹．

与体外培养的二维细胞不同，在体内生长的细胞与附近的细胞和细胞外基质(ECM)相互作用，形成复杂的通信网络，控制许多细胞过程²．新的3D培养方法鼓励细胞聚集成簇，从而形成重要的通信网络，并更紧密地模仿体内结构。由于这些细胞团簇，或球形，相对于微孔的整个区域是非常小的，基于ppm的精确检测可能是困难的。对球体进行成像，结合细胞分析而不是整个井的分析，可以提供更大的灵敏度和信息。

在这里，我们研究了将培养成三维显微组织的细胞暴露于缺氧大气条件下的影响。动态监测是通过在11小时内进行全井单色仪的读取和成像来实现的。通过细胞分析，对全井和全图像荧光强度值的变化，以及单独组成球体的细胞的变化进行分析，展示了后者如何允许对最终效果进行更准确的描述。

材料与方法

材料

细胞

3D InSight™人肝微组织由原代人肝细胞组成，购自InSphero, Inc. (Cambridge, MA)。

试剂

Hoechst 33342(目录号H3570)从Life Technologies (Carlsbad, CA)购买，而缺氧红色检测试剂，是Cyto-ID®缺氧/氧化应激检测试剂盒(目录编号:ENZ-51042)由Enzo生命科学公司(Farmingdale, NY)捐赠。

仪表

的Cytation™3细胞成像多模式阅读器用于执行基于动力学单色仪的微板阅读，以及显微组织的成像。仪器保持37°C和8% O₂监测过程中的大气条件通过使用软件设置和气体控制模块。

方法

细胞繁殖

在进行实验之前，每2 - 3天更换96孔GravityTRAP™板中含有3D肝脏显微组织的培养基。

缺氧研究细胞制备

将96井GravityTRAP™板中的介质移除，代之以含有Hoechst 33342的介质。将培养皿放回组织培养箱10分钟。再次除去培养基，用含有500 nM Cyto-ID缺氧试剂的新鲜培养基代替。然后将培养基和显微组织转移到一个空GravityTRAP™板中进行实验。

Cell /球体成像

在初始细胞成像之前，Cytation 3的温度控制设置为37°C，气体控制模块设置为8% O₂．向仪器中注入氮气以维持8%的氧₂的水平。采用不连续动力学程序在11小时内每小时进行一次微板读取和成像。采用Ex. 596 nm/Em单色检测系统完成微板读数。670纳米设置。使用DAPI和Texas Red成像滤波器立方体进行成像，分别从Hoechst 33342和Cyto-ID缺氧试剂中捕获信号，放大倍数分别为4倍和10倍。每个立方体由适当的彩色LED激励源，以及激励和发射滤波器和二色镜组成。在0时间成像之前手动设置图像捕获设置，以确保来自缺氧试剂的信号可以在背景上方捕获，同时也确保后续图像中的像素不会过度曝光。

缺氧红色检测试剂信号分析

基于全井单色器的信号检测

通过前面描述的单色仪激发和发射设置，通过PMT从整个井中捕获缺氧试剂的总信号强度。

基于全图像LED/ ccd的信号检测

从整个图像中捕获来自缺氧试剂的平均信号强度，使用4倍或10倍物镜。LED激励和16位CCD相机的结合增加了激励信号，也提供了一个更灵敏的方法从细胞信号检测。

全球面LED/ ccd信号检测

如前所述，使用Gen5软件对捕获的10倍球体图像进行细胞分析。这样做是为了只分析来自球形细胞本身的荧光信号，而忽略图像的所有其他部分。表1描述了使用的参数。

表1。10x图像元胞分析参数。

结果与讨论

利用动力学微板读取的荧光信号以及4倍和10倍成像来分析将肝脏显微组织暴露于低氧(缺氧)条件下的影响。图1展示了使用10x物镜拍摄的图像。注意红色缺氧信号的增长，最终压倒了赫斯特信号。11小时后，组成球形细胞的血浆和核膜的完整性似乎已经破裂，将标记DNA从细胞核释放到大块溶液中。

图1．Hoechst 33342染色细胞核和缺氧红试剂的10倍叠加图。肝脏显微组织在37°C/8% O下孵育0、3、6和11小时后捕获的图像₂．

基于单色检测的低氧诱导监测

使用80的PMT增益和前面描述的激发和发射波长，对整个被监测井的缺氧红色试剂荧光信号进行量化。

图2．用单色法检测低氧红色试剂的动态荧光信号。

从图2的结果可以看出，荧光值在11个小时的时间段内没有显著变化。这一现象的原因是肝脏显微组织的面积大约比96孔微量滴定板的孔的面积小1000倍(图3)。基于ppml的光学器件旨在从孔中捕获尽可能多的光，因此对于活细胞显微组织分析，这些光学器件收集大量背景，从图2中的时间响应中明显可见。

图3。典型肝脏显微组织与96孔微量滴度板孔的相对尺寸比较。

基于图像的缺氧诱导分析

使用4倍和10倍成像以及Gen5™数据分析软件的图像统计分析功能对缺氧红色试剂荧光信号进行量化。计算了使用德州红成像滤光器立方体在整个图像中捕获的缺氧试剂的平均荧光。通过这种方法，只测量含有肝脏组织的孔中更小、更聚焦的部分的信号，减少了收集到的背景量。图4展示了用4x和10x物镜成像并用于分析的部分井。

图4一．使用德州红成像滤镜立方体捕获肝脏组织的4倍动力学图像。

图4 b。使用德州红成像滤镜立方体捕获肝脏组织的10倍动力学图像。

从4x和10x图像计算的平均荧光值(图5)可以明显看出，LED激发和基于ccd的量化结合，以及能够聚焦于包含感兴趣样本的井的更小部分，可以对来自缺氧试剂的信号变化进行更可靠的分析。当关注10倍图像分析的结果时尤其如此，在每个时间点都可以看到荧光信号的稳步增加。

图5。缺氧红色试剂的平均荧光值计算从4倍和10倍的动力学图像。

使用Gen5™，使用Texas Red成像滤镜立方体捕获的10x图像进行细胞分析。通过设置表1中列出的参数，该软件能够定义肝脏组织周围的掩膜(图6)。

图6。使用表1中列出的标准，Gen5在肝组织周围绘制物体掩膜。

这允许信号量化从整个对象作为一个整体，而不是从每个单独的单元。使用该技术，只计算绘制掩模内的荧光，而忽略图像中其余的背景信号。由于这一事实，在潜伏期可以看到荧光信号的巨大变化(图7)。

图7。缺氧红色试剂的平均荧光值计算从细胞分析的10倍德州红图像。

当使用四种信号量化方法计算的荧光值进行折叠变化分析时(图8)，可以观察到细胞分析方法在荧光信号随时间的变化中产生了最大的变化，因此是评估这类实验结果的最可靠的方法。

图8。缺氧红色试剂荧光信号折叠变化分析。按以下公式计算的折叠变化:(平均RFU_时间X/平均RFU_时间为0）.

结论

这里提出的结果说明了细胞id缺氧红色检测试剂，以及执行动力学读取和成像的能力Cytation 3通过加入气体控制模块，在保持恒定的适当低氧条件的同时，可以结合起来方便、准确地监测肝脏显微组织细胞模型中的缺氧诱导。此外，对各种可用的荧光信号检测和分析方法的比较表明，专门针对感兴趣的对象限制信号量化如何能够产生最高的信号与背景比，从而产生最大的响应。

参考文献

1. 藏,r;李,d;唐,即;王,j .;以细胞为基础的药物发现的高通量筛选分析。j .生物技术。好。中国沙漠，2012,1,31-51。
2. 少量,M.J.;Radisky特区;Rizki, a;韦弗,V.M.;组织原则:正常乳腺和恶性乳腺中的微环境影响。差异化2002,70,537-546。

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