暴露于游离脂肪酸的HepG2细胞的脂质积累

基于图像的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型分析

作者: Paul Held，博士，美国佛蒙特州Winooski市BioTek仪器有限公司应用部门实验室经理

摘要

NASH的非酒精性脂肪性肝炎是一种常见的肝病，其主要特征是肝脏脂肪增多并伴有炎症，可导致肝脏损伤和肝硬化。虽然没有确定的原因已经确定，但怀疑许多脂肪酸代谢物的细胞毒性。脂肪滴的形成被认为是脂肪酸衍生物种引起的脂肪毒性的标志。在这里，我们检查了暴露于棕榈酸和油酸的HepG2细胞中脂滴的产生。

简介

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是一种常见的、与酒精性肝病相似的“无声”肝病，但发生在很少喝酒或不喝酒的人身上。虽然NASH、NASH肝硬化和NASH相关的肝细胞癌越来越普遍，但对其原因的理解仍不明确。NASH的主要特征是肝脏中的脂肪，以及炎症和损伤(图1)。

图1所示。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)肝活检三色染色。图像显示肝细胞球囊性变性(大细胞，小细胞核位于中央)，伴有细鸡丝样纤维化，肝细胞坏死和炎症。图片由Nephron提供^[1]， cc by-sa 3.0，https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=7747223

人体内的主要脂肪酸是棕榈酸和油酸^[２]．这些游离脂肪酸通过转运机制被肝细胞吸收并转化为三酰甘油酯(图2)^［5］．了解游离脂肪酸在细胞内的吸收及其在细胞毒性中的作用对阐明NASH的原因至关重要。

图2。游离脂肪酸转化为中性脂质。游离脂肪酸如油酸和棕榈酸被肝细胞内化，并通过与甘油的酯化转化为中性脂质三酰甘油。

当这些脂质堆积时，它们形成液滴，可以使用脂质特异性染色剂如尼罗红或BODIPY 493/503进行检测。这些亲脂性斑点很容易穿过多聚甲醛固定细胞的膜，在那里它们分裂成中性脂滴，并显示荧光显著增加(图3)。^(4、6)．

图3。HepG2细胞中性脂质染色。用0.5 mM油酸和棕榈酸混合物攻毒HepG2细胞24小时，用4% PFA固定，并用BODIPY 493/503(绿色)染色，染色中性脂质;DAPI(蓝色)，染色细胞核;以及德州红法洛尼丁(红色)，用来染色肌动蛋白。使用Cytation™5细胞成像多模式阅读器捕获的三色20X图像。标尺为100 μm。

材料与方法

细胞培养

HepG2细胞在添加10%胎牛血清和青霉素-链霉素的高级DMEM中培养，37℃，5% CO₂．培养物常规胰酶化(0.05%胰蛋白酶- edta)，符合率为80%。在实验中，细胞被镀到康宁3904黑边透明底部96孔微板上，根据实验的不同，每孔1万个细胞。

固定和染色

所有用于细胞固定和荧光染色的细胞清洗和试剂添加均使用EL406™清洗机进行。用200 μL PBS (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 7.4 mM)冲洗细胞2次，然后加入100 μL 4%对甲醛(PFA)溶液。在室温下固定10分钟，然后用200 μL PBS冲洗2次。用50 μL DAPI、尼罗红或BODIPY 493/503染色液在室温下染色30分钟，然后用200 μL PBS洗涤2次。吸吸后，在所有孔中加入100 μL PBS，用光学透明的TopSeal-A胶粘剂封板(PerkinElmer)。制备的平板在5℃保存，在成像前避光。

成像

实验使用Cytation™5细胞成像多模式阅读器(BioTek Instruments, Winooski, VT)，配置DAPI, GFP和RFP和光立方体。该成像仪使用LED光源结合带通滤波器和二色镜来提供适当波长的光。

DAPI光立方使用337/50激励滤波器和447/60发射滤波器，GFP光立方使用469/35激励滤波器和525/39发射滤波器，RFP光立方使用585/29激励和624/40发射滤波器，而DAPI光立方使用586/15激励和647/57发射滤波器。

图4。脂质积累和染色过程。使用MultiFlo™FX泵泵分配器将细胞常规接种到96孔微板中，并放置一夜。第二天，用不同浓度和不同暴露时间的油酸和棕榈酸游离脂肪酸的混合物(3:1)挑战细胞。细胞用4%多聚甲醛固定10分钟，然后用DAPI(细胞核)、Texas Red-phalloidin(肌动蛋白)和BODIPY 493/503或Nile Red(中性脂质)染色30分钟。然后使用cyation 5对细胞成像，并使用Gen5™Microplate Reader和Imager软件对图像进行分析。

荧光微板读取器测量

用DAPI、Nile Red或BODIPY 493/503染色的细胞荧光用Cytation 5细胞成像多模式读卡器测定，读卡器使用光谱滤镜/二色微板读卡器光学。DAPI荧光检测采用360/20 nm激发，发射460/20 nm，尼罗河红荧光检测采用530/15 nm激发，发射570/15。为了解释细胞位置的变化，我们用4 x 4区域扫描测量荧光，并对结果取平均值。利用DAPI荧光对每孔的尼罗红信号进行归一化处理，校正细胞数量的差异。数据为8次测定的平均值。

图像分析

对捕获的数字图像进行一级和二级掩膜分析，以确定脂质阳性细胞的百分比。DAPI通道的初级掩码分析通过细胞核识别单个细胞。次掩膜表示为每个细胞核周围小于30 μm的区域，代表细胞的细胞质区域(图5)。根据实验的不同，使用阈值分析来确定脂质阳性细胞的百分比，或使用该区域的总荧光(积分)来计算细胞脂质含量的变化。用亚群体双掩膜对象分析计算脂质阳性细胞的百分比。初级掩膜识别单个核;用所述次级掩码在空间上连接到所述初级掩码。用6 x10的荧光阈值定量脂质阳性亚群⁶．数据表示为使用主掩码获得的总单元计数的百分比。数据为8次测定的平均值。

在同一口井中，用10x物镜、3 x 3格式拍摄了多色图像，每口井的不同位置有9张离散图像。

图5。图像数据的定量分析。DAPI通道的初级掩码分析通过细胞核识别单个细胞。二次掩模由主掩模周围不超过30 μm的空间识别。(A)原始图像;(B)用黄色痕迹识别的初级掩模;(C)用黄色痕迹识别初级和次级掩模;(D)用蓝色痕迹识别的脂质阳性细胞的一级和二级掩膜。标尺为30 μm。

结果

将HepG2细胞与浓度增加的游离脂肪酸混合物孵育，可形成细胞内中性脂质。尼罗红，在脂质环境中明显比在水环境中更荧光^{[3 - 4]}，可以使用基于ppml的荧光测量或基于图像的亚种群分析进行检测(图6)。

图6。不同浓度的游离脂肪酸处理的Hep G2细胞的脂质积累。暴露24小时后，使用尼罗红荧光技术评估脂滴形成，使用ppm基微板读取光学(Well荧光)或基于图像的亚群体分析(%细胞积累脂质)。

从图6中可以明显看出，基于图像的亚种群分析确定了视野中脂质阳性细胞的百分比，在评估脂质积累方面比基于ppm基的阱荧光提供了更大的敏感性。棕榈酸和油酸3:1的混合物被用于模拟这些实验在活的有机体内条件。如果分别研究这两种游离脂肪酸在中性脂质形成中的作用，显然油酸起着主要作用。仅用50 nM油酸刺激细胞会导致显著的脂质积累;但使用相同浓度的棕榈酸不会产生明显的脂质(图7)。然而，如果同样的50 nM油酸与更大剂量的棕榈酸一起使用，典型的在活的有机体内在这种情况下，脂质产生明显增加。但是，如果棕榈酸浓度降低到与油酸浓度相等，这种效果就会消失。

图7。油酸和棕榈酸对脂质积累的作用。HepG2细胞分别被油酸和棕榈酸在50 nM或油酸在50 nM与更高或相等剂量的棕榈酸挑战。

多种染料能够在水环境中检测中性脂滴。我们比较了两种亲脂性染料，尼罗红和BODIPY 493/503，就它们识别和定量细胞内脂质的能力而言。当用尼罗红和BODIPY 493/503染料对FFA挑战细胞进行固定和染色时，图像显示这两种染料共同定位于细胞质(图8)。固定的HepG2细胞用DAPI染色以识别细胞核，而嗜脂性染料只在细胞质中显示脂质染色。(图8B和8C)。用两种染料染色的细胞的重叠图像表明，细胞质中的相同区域被染色(图10D)。

图8．脂质染色染料的共定位。HepG2细胞用0.25 mM FFA攻毒24小时，然后用4% PFA固定，用DAPI(细胞核)和尼罗红和BODIPY 493/503脂质染色。(A) DAPI图像;(B) DAPI和尼罗红;(C) DAPI和BODIPY;(D)尼罗河红和BODIPY。

进一步的图像分析也表明，这两种染料都适用于定量分析。利用亚群体分析，从两种染料的混合污染中鉴定出脂质阳性细胞。虽然染料强度要求使用不同的阈值，但当HepG2细胞受到FFA刺激并随时间监测时，两种染料的阳性细胞百分比非常一致(图9)。

图9。脂质染料检测脂质含量增加的比较。HepG2细胞受500 nM FFA和脂质阳性细胞百分比随时间的变化而变化。细胞固定并用DAPI染色以识别细胞核，用BODIPY 493/503或尼罗红染色以识别中性脂质。用亚群体双掩模对象分析计算阳性细胞的百分比。初级掩膜识别单个核;用所述次级掩码在空间上连接到所述初级掩码。脂质阳性亚群体的阈值为1.2x10⁶和2.5 x10⁶分别为BODIPY 493/503和尼罗红染色剂。

许多化合物已被证明会影响脂肪肝的形成在活的有机体内．该方法用于体外测试化合物影响HepG2细胞中性脂滴形成的能力。以未处理的细胞为阴性对照，以250 nM FFA处理的细胞为阳性对照，试验了四种不同化合物对体外中性脂质形成的影响。如图10所示，在这些实验中，只有丁酸钠被证明可以改变脂质的形成。100 μM丁酸钠的存在使脂质形成减少70%。与对照组相比，肼产生了轻微但统计上不显著的细胞脂质阳性数量增加。

图10。化合物对中性脂质形成的影响。将不同浓度的脂肪肝形成效应物与0.25 mM FFA混合物同时添加到HepG2细胞中。24小时后，细胞固定并进行脂质染色。百分比响应反映了在扣除无刺激对照后，每个浓度的细胞数归一化的总脂质染色与FFA刺激对照的比值。数据表示7次测定的平均值。

讨论

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一系列从肝细胞脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)到肝细胞癌的疾病^[7]．肝脏脂肪变性和NASH都可以通过几种分子途径发生。自由脂肪酸(FFA)摄取增加，脂肪新生和内质网(ER)应激是NAFLD进展的相关机制^(8、9)．在这里，我们描述了一种表型为基础的分析，可用于监测这些影响在体外。通过使用两种不同的亲脂染料，我们证明了FFA可以被HepG2细胞吸收，并以剂量和时间依赖的方式酯化成中性脂类。负责脂质积累的主要脂肪酸是油酸，但如果棕榈酸的浓度明显高于其游离脂肪酸伙伴，则棕榈酸似乎对脂质产生有促进作用。两种染料均可根据实验需要使用不同的荧光色通道进行分析。

作为概念证明，这种分析格式被用于测试已知和未知的脂肪肝影响因素体内。丁酸钠被证明在防止脂质形成方面具有相当的保护作用，可能是通过缓解内质网应激。

Cytation™5细胞成像多模式阅读器具有许多功能，可实现中性脂滴成像。四个独立的LED位置允许使用多个不同的放大倍率显微镜物镜进行多重荧光成像。除了脂滴的鉴定外，细胞质标记物或细胞核的反染色可提供细胞位置信息。此外，该成像仪可容纳6个目标，放大倍数可达60倍。Gen5™Microplate Reader and Imager Software提供了微板细胞的自动聚焦，用自动或用户定义的参数(LED强度，CCD增益，集成时间等)和细胞分析算法捕获图像，允许细胞分割和细胞计数。用于控制阅读器功能的Gen5软件还能够执行自动图像分析，如计数满足荧光阈值和大小标准的细胞。

参考文献

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