2022卡塔尔世界杯完整赛程参考资料-申请须知

IMiD分子胶及其靶族的动力学降解

下载

相关产品:乐鱼平台入口BioSpa 8，协同Neo2

2022年3月17日

作者:安捷伦科技公司Paul Held和Jason GreeneWinooski, VT，美国;Sarah D. Mahan, Danette L. Daniels，和Thomas Machleidt Promega公司麦迪逊，威斯康星州，美国

摘要

靶向降解致病蛋白已被证明是一种有效的治疗方法。在活细胞中连续监测内源性蛋白水平上相关靶类降解的特异性，对于理解这些化合物的功效和机制至关重要。本应用说明展示了利用Promega Nano-Glo HiBiT技术与安吉伦BioTek结合，对几种关键免疫调节药物(IMiD)分子胶靶标IKZF1 (Ikaros)、GSPT1和IKZF2 (Helios)与各种IMiDs进行并行降解和活性筛选的自动化2022世界杯附加赛决赛BioSpa 8自动化孵化器和安捷伦BioTek2022世界杯附加赛决赛协同Neo2混合多模式阅读器。

简介

对致病蛋白质进行定向蛋白质降解已被证明是一种强有力的治疗方法，特别是在肿瘤学领域，使用称为"分子胶水"的小分子IMiDs。1 - 4萨力多胺是这类分子中的第一种化合物。它最初是在20世纪50年代作为止吐剂开发的，但被发现有致畸作用，随后被撤出市场。萨力度胺的致畸性刺激了对其抗癌特性的探索。萨力度胺的主要细胞靶点是小脑(CRBN)，一种cullin-RING连接酶4 (CRL4)的底物受体。5IMiDs以CUL4- RBX1-DDB1-CRBN (CRL4CRBN) E3连接酶复合物为靶点，诱导Ikaros家族锌指蛋白(IKZF家族)、Ikaros (IKZF1)和Aiolos (IKZF3)的泛素化和蛋白酶体降解。Ikaros家族锌指蛋白是骨骼瘤细胞存活所必需的淋巴样转录因子。6、7、8IMiDs，如沙利度胺，包含一个保守的戊二酰亚胺环和一个可变的邻苯二酰环。戊二酰亚胺环与CRBN的一个保守的疏水囊相互作用。9 - 11自那以后，人们开发了几种衍生物来提高药效。监测相关靶类降解的特异性以及活细胞内内源性蛋白水平的能力，对于理解治疗性化合物的疗效和机制至关重要。HiBiT CRISPR内源性标记的应用为广泛的细胞类型和细胞系中内源性蛋白的活细胞检测提供了一种高度敏感和定量的方法。12 - 14HiBiT的高灵敏度和定量能力使得该技术可以很容易地应用到HTS平台中，用于识别新型小分子降解物，如PROTACS和分子粘合剂。15日16此外，细胞健康分析的同孔复用可以获得关于这些化合物如何影响细胞活力的额外信息。本应用说明使用BioSpa和Synergy Neo2仪器，展示了几个关键的IMiD分子胶靶标，IKZF1 (Ikaros)， GSPT1 (G1到S相变1)和IKZF2 (Helios)与各种IMiD药物的并行降解和活性筛选。

实验


纳米glo HiBiT技术

来自Promega公司(Madison, WI)的Nano-Glo HiBiT提供了一种快速和高灵敏度的方法来标记和检测各种细胞类型和细胞系中的内源性蛋白质。该报告系统基于分裂的NanoLuc，包括一个11个氨基酸的肽(HiBiT)，它与一个18 kDa的多肽(LgBiT)具有非常高的亲和力。高效形成的明亮发光复合物使hibittag蛋白的高灵敏度和定量分析成为可能HiBiT的小尺寸使其成为高效和不引人注目的内源性蛋白质标记的最佳选择，通过cas9介导的同源定向修复使用单链供体寡核苷酸(ssODN)模板。通过在裂解缓冲液中加入LgBiT蛋白和底物，可以快速和可扩展地检测细胞裂解物中的hibit标记蛋白。另外，LgBiT的共表达可以在活细胞中进行检测，实时分析蛋白质丰度在长时间内的变化，特别是当与延长活细胞底物(如Nano-Glo Endurazine)结合时，如图1所示。HiBiT的高灵敏度，结合灵活的检测方式，使HiBiT成为研究靶向降解作为一种治疗方法的理想工具。此外，发光检测的简单性使得HiBiT可以很容易地实现到HTS平台中，用于识别新型小分子降解物，如PROTACS和分子粘合剂。15日16

HiBiT蛋白标记技术

图1所示。HiBiT蛋白标记技术。通过Cas9核糖核蛋白(RNP)与ssODN修复模板结合同源定向修复，编码感兴趣蛋白质的基因组位点可以被标记。标记蛋白可以在裂解终点试验中检测到，也可以通过在活细胞中共表达LgBiT来检测。


仪表

BioSpa 8自动化培养箱可以将安捷伦BioTek阅读器或成象器与安捷伦BioTe2022世界杯附加赛决赛k洗衣机和/或分配器连接起来，实现多达8个微板的完整工作流程自动化。安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek BioSpa活细胞分析系统在测试运行过程中提供温度、气体和湿度控制。本应用中使用的BioSpa系统包括BioSpa 8自动培养箱和Synergy Neo2混合多模式阅读器，可在24小时内自动化多个平板的动态活细胞工作流程。BioSpa 8按需模式软件为多个读取器协议提供了一个简单、高效的界面，每个板的启动时间都很灵活。BioSpa 8软件集成并安排孵化、平板读取和数据分析，同时提供所有环境条件和处理步骤的持续监测。在测试运行过程中，BioSpa 8将运输指定的微板并将其展示到Synergy Neo2载体上，届时BioSpa 8软件将在Agilent BioTek Gen5微板阅读器和成像软件中启动编程的平板阅读器实验。2022世界杯附加赛决赛一旦完成，数据被电子存储，然后板被送回BioSpa 8。

Synergy Neo2多模式阅读器是为筛选实验室设计的，具有速度和超高的性能。变带宽四色单色仪;敏感，高透射，基于滤光的光学;激光时间分辨荧光(TRF);多达四个光电倍增管(pmt)提供快速测量。Synergy Neo2使用独立的光路，确保在所有检测模式(包括吸收、荧光和发光)下的性能不受影响。阅读器使用条形码标记的过滤器立方体，以帮助简化工作流程和限制错误。先进的环境控制，包括CO2/ O2控制;70°C孵育;和可变震动，可支持活细胞测定。

材料与方法

通过在IKZF1的c端或IKZF2的n端插入HiBiT标签，利用CRISPR/Cas9对稳定表达LgBiT蛋白的Jurkat细胞进行进一步修饰。稳定表达LgBiT蛋白的HEK293细胞通过在GSPT1的n端插入HiBiT标记进行类似的修饰。表达IKZF1-HiBiT的细胞在3个96孔板上进行检测(每个处理或对照条件n=3)，表达HiBiT-IKZF2或HiBiT-GSPT1的细胞在384孔板上进行检测(每个处理或对照条件n=4)。HiBiT发光和CellTox Green荧光每30分钟测量一次，持续20小时。所有试验均遵循先前发表的实验程序和数据分析方法。15

结果与讨论

通过IKZF1-HiBiT融合蛋白可以观察到几种IMiD化合物的靶向降解，如图2所示。在这个构型中，HiBiT标签位于IKZF1内源性基因座的c端。有趣的是，尽管已知疗效，萨力度胺只显示出适度的降解活性，而基本结构的化学衍生物明显更有效。

IKZF1-HiBiT活细胞降解。

图2。IKZF1-HiBiT活细胞降解。IKZF1-HiBiT KI Jurkat (LgBiT)细胞(Promega)在纳米glo Endurazine (Promega)和CellTox绿色染料(Promega)的存在下镀至96孔板，每孔10万个细胞，用沙利度胺、来那度胺、波马度胺和伊比利亚多胺的浓度系列处理，或DMSO对照。将各时间点处理条件的原始RLU值除以DMSO对照的原始RLU值，将相对光单位(Relative light unit, RLU)值转换为分数发光值。所有化合物的浓度以μ M表示。数据表示技术三个副本的平均分数RLU±SD(误差条)。


每种化合物在固定时间点的动力学数据可用于生成剂量-响应曲线。通过使用有约束的Hill slope四参数模型，可以比较不同化合物的药效，如图3所示。Dmax的比较50结果表明，伊比利亚多胺的诱导降解能力是波马度胺的6倍，是来那度胺的18倍。此外，与来那度胺相比，iberdomide和pomalidomide能够诱导明显更多的降解(图3)。

有效降解处理的Jurkat细胞

图3。有效降解处理的Jurkat细胞。图2所示的数据用于确定降解最大值(Dmax)， Dmax定义为随着时间的推移达到的最低分数RLU值，并为每种处理浓度确定。Dmax值与浓度和Dmax值对应50如前所述，数值由四参数、非线性回归曲线拟合的每种复合处理得到。14、15

当伊比拉多胺、波马度胺和来那度胺靶向修饰HEK293细胞中内源性的hibit标记GSPT1蛋白时，很少观察到降解，如图4所示。在这种构型中，HiBiT位于GSPT1内源性位点的n端。IMiD化合物CC-885是已知的Ikaros家族锌指蛋白降解的有效诱导剂，也能引起翻译终止因子GSPT1的降解。这可以在图4A的动力学发光图中观察到。的距离50该化合物的含量为170 pM，如图4B所示。

由IKFZ2编码的蛋白质，锌指蛋白Helios，不是IMiDs测试的降解目标。如图5所示，在20小时的曝光中，无论使用何种化合物，分数发光的变化都非常小。

HEK293细胞中HiBiT-GSPT1活细胞降解。

图4。HEK293细胞中HiBiT-GSPT1活细胞降解。(A) HiBiT-GSPT1 KI HEK293 (LgBiT)细胞(Promega)在纳米glo Endurazine和CellTox绿色染料的存在下被镀至384孔板，每孔8000个细胞，并用沙利度胺、来那度胺、波马度胺、iberdomide和CC-885浓度系列处理，或DMSO对照。分数发光的计算如前面所述。所有化合物的浓度以μ M表示。数据表示技术四副本的平均分数RLU±SD(误差条)。(B)降解最大值(Dmax)，定义为随着时间的推移所达到的最低分数RLU值，为CC-885确定并用于推导Dmax50价值。

HiBiT-IKFZ2在Jurkat细胞中的活细胞降解。

图5．HiBiT-IKFZ2在Jurkat细胞中的活细胞降解。HiBiT-IKZF2 KI Jurkat (LgBiT)细胞(Promega)在纳米glo Endurazine和CellTox绿色染料的存在下被电镀到384孔板，每孔5万个细胞，并用沙利度胺、来那度胺、波马度胺和伊比利亚多胺的浓度系列处理，或DMSO对照。分数发光的计算如前面所述。所有化合物的浓度以μ M表示。数据表示技术四副本的平均分数RLU±SD(误差条)。


细胞健康可以在蛋白质降解试验中同时进行测试。CellTox绿色染料是一种非永久性细胞染料，在与核酸结合时具有很强的荧光。健康的细胞有完整的细胞膜，可以有效地排除染料，而受到毒性损害的细胞细胞膜会受损，不能排除染料。与无毒化合物相比，具有细胞毒性的化合物随着时间的推移会产生更多的荧光。图6所示的代表性数据表明，与未处理的阴性对照相比，最高浓度的IMiDs (1 μ M)不会导致Jurkat或HEK293细胞的荧光增加，因此在这些测试浓度下不会影响细胞健康。

Jurkat-IKFZ1-HiBiT和HEK293 HiBiT-GSPT1细胞的多路细胞健康

图6。Jurkat-IKFZ1-HiBiT和HEK293 HiBiT-GSPT1细胞的多路细胞健康。如前所述，CellTox Green细胞毒性试验与图2 - 5中所示的动力学降解数据进行了复联有代表性的数据分别为Jurkat IKZF1-HiBiT和HEK293 HiBiT-GSPT1细胞。通过将各时间点处理条件的原始RFU值除以DMSO对照的原始RFU值，将RFU数据转换为分数RFU进行归一化。用细胞裂解对照(100µg/mL洋地黄苷)的原始RFU值除以DMSO对照的原始RFU值计算出相对最大裂解控制值，并在每张图上提供参考。所示为每次实验使用的最高化合物浓度(1µM)处理的代表性结果。数据表示技术四胞胎的平均分数RFU±SD。

多路复用与荧光细胞活力测定表明，在本实验测试的时间框架内，复合处理不会导致显著的细胞死亡。这表明观察到的靶蛋白丰度的下降是化合物特异性降解，而不是细胞死亡的结果。

这些数据表明BioSpa 8与Synergy Neo2结合可以可靠地自动化hibit标记的蛋白质降解分析。几种不同的IMiD化合物被成功地测试了对不同hibit修饰细胞系的活性。这些结果与之前发表的数据相吻合，在这些数据中，培养皿是手动运行的，而不是使用机器人孵化器。3、4、15

这种仪器组合允许多个板同时运行。按需BioSpa软件允许在多个检测板开始时摇晃，使机器人能够连续地将板穿梭到多模式阅读器，同时保持统一的读-读时间。在读取之间，板被送回环境控制的培养箱。通常，一个平板会占用读者的整个动力学分析。除了多版外，该系统还可以容纳不同的版式。96孔和384孔微板同时使用。除了控制检测时间外，BioSpa 8软件还可以将特定的读取器协议文件附加到特定的板上。同时运行多个板的能力极大地提高了吞吐量并降低了人员成本。例如，如果没有BioSpa 8，运行4个独立的平板将需要4个连续的20小时运行，需要4个独立的检测制剂。同时运行多个平板的能力只需要一种检测制剂，这消除了一些潜在的检测变异，并提供更好的检测统计。 Alternatively, the assays could be carried out manually, where a researcher would be required move individual plates from a tissue culture incubator to the reader carrier and initiate the detection step, over the same 20-hour time period.

结论

对于所有数据，任何给定HiBiT CRISPR靶点的IMiD化合物之间的降解差异，以及家族成员特异性，都与之前发表的数据相匹配。3、4、15用荧光细胞活力试验进行多路复用表明，在本实验测试的时间框架内，复方处理没有导致显著的细胞死亡。这表明观察到的靶蛋白丰度的下降是化合物特异性降解，而不是细胞死亡的结果。将用于降解筛选的HiBiT CRISPR技术与安捷伦BioTek BioSpa 8自动培养箱按需方法相结合，可以从所有五个检测板并行收集多重发光2022世界杯附加赛决赛和荧光数据。这大大节省了实验设置和执行的时间。使用安捷伦BioTek2022世界杯附加赛决赛 Synergy Neo2混合多模式读取器可生成HiBiT发光和CellTox绿色荧光活细胞分析的高鲁棒性和可重复性数据。

参考文献

  1. Deshaies, RJ。蛋白质降解:PROTACs的黄金时间。中国生物化学杂志2015,11:634-635。
  2. 赖,交流;人员,厘米。诱导蛋白降解:一种新兴的药物发现范式。药物研究2017,16:101-114。
  3. 张伯伦,页;D \ ' agostino博士拉;埃利斯,JM;汉森,JD;Matyskiela,我;麦当劳,JJ;里格斯,小;哈曼,LG。小脑介导的蛋白质降解作为一种治疗方式的进化。美国医学化学杂志2019,10:1592- 1602。
  4. 张伯伦,页;哈曼,LG。靶向蛋白质降解疗法的发展。中国生物化学杂志2019,15:937-944。
  5. 伊藤、T;安藤,H;铃木T;Ogura T;Hotta K;导演今村昌平,Y;山口,Y;沙利度胺致畸作用的一个主要靶点的鉴定。科学通报，2010,29(5):559 - 561。
  6. 陆,G;米德尔顿,再保险;太阳,H;Naniong, M;奥特,CJ;Mitsiades CS;黄,乐;他,我;骨髓瘤药物来那度胺促进Ikaros蛋白的脑依赖性破坏。科学通报，2014,38(5):559 - 561。
  7. Kronke J;Udeshi ND;Narla,;好莱坞,P;赫斯特,SN;麦科恩,M;Svinkina T;Heckl D;来者,E;李,X; et al. Lenalidomide Causes Selective Degradation of IKZF1 and IKZF3 in Multiple Myeloma Cells. Science. 2014, 343(6168):301–5.35.
  8. 斯图尔特,正义与发展党。医学。萨力多胺是如何对抗癌症的。科学通报，2014,38(6):629 - 634。
  9. 费舍尔,ES;玻姆,K;Lydeard,小;杨,H;Stadler MB;Cavadini年代;内格尔,J;Serluca F;Acker V;Lingaraju,通用; et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 Ubiquitin Ligase in Complex with Thalidomide. Nature. 2014, 512(7512):49– 53.43.
  10. 张伯伦,页;Lopez-Girona,;米勒,K;卡梅尔,G;Pagarigan, B;Chie-Leon, B;Rychak E;畜栏,LG;任,YJ;王,M; et al. Structure of the Human Cereblon-DDB1- Lenalidomide Complex Reveals Basis for Responsiveness to Thalidomide Analogs. Nat Struct Mol Biol. 2014, 21(9):803–9.44.
  11. 风格的作品,G;费舍尔,ES;托马,在北半球。来那度胺诱导CRL4泛素连接酶降解ck1 α的结构基础。自然学报，2016,532(7597):127-30。
  12. ,可于;Machleidt T;齐默尔曼,K;艾格斯,CT;迪克逊,;赫斯特,R;大厅,议员;Encell LP;Binkowski男朋友;木材、KV。 CRISPR-Mediated Tagging of Endogenous Proteins with a Luminescent Peptide. ACS Chem Biol 2018,
  13. 467 - 474。13.,可于;史蒂芬,LS;齐默尔曼,K;木材、KV;内源性蛋白质动态分析的一个简单和可扩展的策略。Sci Rep 2020, 10:8953。
  14. 丰富,公里;马汉,年代;电晕、铬;麦克杜格尔,M;Vasta JD;穿长袍的人,MB;Urh, M;丹尼尔斯,DL。PROTAC作用模式的定量活细胞动力学降解和机理分析。美国化学生物学报2018,13:2758-2770。
  15. 丰富,公里;马汉,SD;Urh, M;丹尼尔斯,DL。利用HiBiT CRISPR细胞系对靶向蛋白降解化合物进行高通量细胞分析。J Vis Exp 2020。
  16. 丹尼尔斯,DL;丰富,公里;M.监测和破译细胞内蛋白质降解途径。今日药物发现技术2019,31:61-68。
  17. 迪克逊,;,可于;大厅,议员;齐默尔曼,K;奥托,P;目前,TH;巴特勒,提单;Binkowski男朋友;Machleidt T;柯克兰,助教; et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chem Biol 2016, 11:400-408.



链接