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利用一种新型生物发光共振能量转移(BRET)近似的高通量筛选方法研究蛋白质:蛋白质相互作用(PPI)

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2016年6月17日

作者: Peter J. Brescia, Jr.和Peter Banks, BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT USA;艾米Landreman,Promega集团美国威斯康星州麦迪逊

Promega

人们已经发现蛋白质在活细胞中起着各种各样的关键作用。为了更好地理解单个蛋白质的功能，能够阐明细胞环境中发生的动态相互作用是很重要的。最近开发的一种试剂平台，在结构和方法上与生物发光共振能量转移(BRET)相似，为研究蛋白质提供了一种新的工具:蛋白质相互作用(PPI)。该系统是一种基于邻近性的检测，依赖于测量从生物发光供体蛋白到荧光标记受体蛋白的能量转移。该检测系统用于以细胞为基础的高通量筛选检测格式研究MDM2和p53的PPI。

简介

虽然有几种方法可以研究活细胞中的蛋白质相互作用(PPI)，但监测这些相互作用仍然很困难。目前的方法主要基于生物化学方法，如免疫共沉淀、双分子荧光互补、酵母双杂交、噬菌体展示、化学交联和近距离连接分析，而物理方法包括生物层干涉测量、动态光散射、表面等离子体共振、荧光偏振/各向异性和荧光能量转移(FRET)。在任何特定的系统中，不同的方法在敏感性和特异性方面有所不同，通常需要多种方法才能进行可靠的确认。

虽然荧光标记的使用在研究PPIs的许多方法中起着重要作用，但对外部光源的需要可能导致荧光团的背景增加和/或光漂白。FRET已被广泛接受为确定两个标记感兴趣分子的接近性的一种研究方法。FRET需要供体和受体荧光团的紧密接触，以便在外部光源的激发下，从供体到受体的能量有效转移。一种类似的方法，生物发光共振能量转移(BRET)，通过利用荧光素酶的生物发光能量作为激发源，最大限度地减少背景噪声和与使用外部光源相关的光漂白噪声，已经获得了广泛的普及。

与BRET类似，NanoLuc™利用NanoLuc®融合蛋白作为能量供体，使用荧光标记的HaloTag®融合蛋白作为受体(图1)。NanoLuc (Nluc)是从深海虾Oplophorus及其相关底物中提取的工程荧光素酶变体，具有上述许多理想的特性1。工程荧光素酶是一个稳定的变种较小的催化亚基(olu -19)从异质体原生结构。当Nluc与衬底结合时，即腔肠嗪类似物呋喃嗪，产生的光比Fluc或Rluc都要亮得多，光谱最大值在454 nm处(图2)。由于样品的生物学性质和光谱重叠，优化的蓝移给体和红移受体对有助于最小化两种检测背景，使其适合于高通量筛选应用。

初步数据包括对供体-受体融合蛋白的分析，用于检测和仪器优化，以及对细胞系统中供体- mdm2和受体-p53融合对的研究。MDM2和p53融合蛋白对被瞬时转化到HEK293细胞中进行分析，包括Z′-因子和药理研究。

NanoBRET实验。

图1所示。NanoBRET™检测。相互作用后，从NanoLuc®-Protein A融合体(供体)到荧光标记的HaloTag®-Protein B融合体(受体)的能量转移示意图。

NanoBRET光谱。

图2．NanoBRET®光谱。HaloTag®NanoBRET®配体的460 nm发射光谱和618 nm荧光发射光谱。基于供体/受体发射的NanoBRET®比例计算。

材料与方法

材料

质粒的制备

NanoBRET™蛋白质:蛋白质相互作用(PPI)系统由NanoLuc®- mdm2和P -53- halo - Tag®融合载体组成，NanoBRET™阳性对照由供体-受体融合蛋白载体组成(P/N:N1641和N1581, Promega Corp.， Madison, WI)使用标准方法转化具有化学活性的大肠杆菌菌株BL21DE3。选择阳性转化子并进行繁殖，制备转染HEK293细胞的质粒库。

细胞培养，瞬时转染和微板播种

采用标准组织培养方法培养HEK293细胞。HEK293细胞在80-90%的融合度下收获，并在2 mL培养基中以80万细胞/孔的密度复制到6孔微板(P/N:3516, Corning Life Sciences, Tewksbury, MA)，并允许附着和恢复4-6小时。HEK293细胞瞬时转染由NanoLuc®-MDM2和P -53- halotag®融合载体组成的NanoBRET™蛋白质:蛋白质相互作用(PPI)系统或由供体-受体融合蛋白载体组成的NanoBRET™阳性对照(P/N:N1641和N1581, Promega Corp.， Madison, WI)。按照制造商的建议进行转染:PPI对照对:2 μg P -53- halotag®融合载体DNA + 0.2 μg NanoLuc®-MDM2融合载体+ 100 μL Opti-MEM®1还原血清培养基，无酚红(P/N: 11058-021,Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)/4% FBS + 8 μL FuGENE®HD转染试剂(P/N: E2311, Promega Corp.)。阳性对照:2 μg转染载体DNA + 0.002 μg NanoBRET™阳性对照载体水稀释+ 100 μL Opti-MEM®1还原血清培养基，无酚红/4% FBS + 8 μL FuGENE®HD转染试剂。蛋白质在37℃，5% CO条件下表达约20小时2．

收集细胞并将其复制到96孔或384孔微板(P/N:3917和3570，康宁生命科学公司)中，添加或不添加HaloTag®NanoBRET™618配体。细胞分别以100或40 μL的体积分布于96或384孔板中，未处理孔的浓度分别为20万细胞/mL，处理孔的浓度为90或36 μL，浓度为22万细胞/mL。经过处理的井分别在96井和384井板上注入10或4 μL化合物/抑制剂。培养皿在37℃，5% CO下培养2，最少4-6小时至过夜(18-24小时)。在Opti-MEM®I培养基中添加25或10 μL的nanoobret™Nano-Glo®衬底，分别用于96孔或384孔板。在Synergy™Neo2上添加底物10分钟内测量供体发射(460 nm)和受体发射(618 nm)。

NanoBRET分析工作流程

图3。NanoBRET™检测工作流程。

仪表

Synergy™Neo2配备了450/50和610/LP双发射滤波器，允许同时检测供体和受体信号。选择了使用顶部光学的发光读取模式。光电倍增管增益设置、信号积分时间和读取高度的优化如下所述并列于表1。

Synergy Neo2读取参数

表1。Synergy™Neo2读取参数。

NanoBRET™计算

NanoBRET计算

结果

读者优化

重复孔或四重复孔分别镀成96孔和384孔的格式，添加或不添加(+/-)配体，并使用特异性抑制剂Nutlin-3处理10 μM或单独载体(DMSO)。每个通道的PMT增益设置都有所不同，并对几个整合时间进行了研究，以确定最佳的检测窗口和读取时间(代表性数据如图4所示)。检测窗口计算为处理细胞和未处理细胞之间的差异。从图4可以明显看出，在两个pmt的增益设置为135的情况下，0.5秒的积分时间在读取速度和响应之间提供了极好的折衷。测试不同的读取高度发现，96孔板和384孔板的最佳读取高度分别为6和8毫米(数据未显示)。

Synergy Neo2多模式阅读器设置优化

图4．Synergy Neo2多模式阅读器设置优化。在不同整合时间和增益设置下，比较处理细胞和未处理细胞的mBU响应之间的增量，以确定最佳的读取器设置。

Z因子的测定

转染后，细胞按以下方式重复:96孔试验格式:10个重复+/-配体用10 μM Nutlin-3处理或单独用载体(DMSO)处理;384孔分析格式:48个重复+/-配体分别用10 μM Nutlin-3处理或用DMSO单独处理。在适当的孵育期后，在10分钟内将平板在Synergy Neo2上读取。底物的添加。如前所述，计算每种化验格式的z′因子。两种检测格式的z′因子均在0.5 - 1之间，表明检测性能稳定，变动性低。

Z的因素

表2．Z的因素。计算每种分析格式的z′因子。

转染的细胞被重复或四复制，分别在96孔或384孔的微板上用不同浓度的抑制剂进行处理。添加了特异性抑制剂Nutlin-3的9点1:3序列稀释系列，包括一个零化合物点。在适当的孵育期后，在添加底物10分钟内将平板在Synergy™Neo2上读取。的集成电路50使用Prism (GraphPad Software, Inc.， La Jolla, CA)的四参数剂量响应曲线拟合确定浓度(图6)5096孔和384孔分析格式的8.4和8.2 μM值与之前发表的数据相关性良好(表3)。

抑制剂滴定。

图5。抑制剂滴定。

IC50值。

表3。集成电路50值。的集成电路50对每种分析格式确定抑制剂Nutlin-3的值。

结论

活细胞生物发光共振能量转移(BRET)试验允许研究动态蛋白质:蛋白质在生物相关环境中的相互作用。所采用的蓝移供体信号和红移受体在复杂的体内环境中提供了良好的信号对背景的转换。Synergy™Neo2通过双PMT配置同时检测BRET供体和受体发射信号，提供了多种信号的快速检测，这是高通量分析格式所必需的。96口井和384口井的读取时间分别为1min:6sec和4min:4sec。

参考文献

  1. Foltman马格达莱纳;Sanchez-Diaz, Alberto(2016):利用共免疫沉淀研究芽孢酵母中的蛋白质-蛋白质相互作用。在分子生物学方法(克里夫顿，新泽西州)1369,239-256页。
  2. 利·a·斯托达特;伊丽莎白·约翰斯通;阿曼达·威尔;高尔丁Joelle;马修·b·罗伯斯;Machleidt, Thomas等人(2015):应用BRET监测配体与GPCRs的结合。在Nat Meth 12(7)， 661-663页。
  3. Hall, M.P.等人(2012)利用新型咪唑吡嗪酮底物从深海虾中提取荧光素酶报告基因。ACS化学。生物学7(1848 - 57)。
  4. 达金，DD.，辛德，SN.。， Shun, TY.， Lazo, JS。， Strock, CJ。，朱利亚诺，堪萨斯州。，泰勒，DL。，约翰斯顿，宾夕法尼亚州。和约翰斯顿，宾夕法尼亚州。(2010)一种新的蛋白质相互作用生物传感器高含量筛选方法的表征和优化，以识别p53和hDM2之间相互作用的干扰物。分析药物开发技术，8,437 -458。

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