永生化角化细胞缺氧和氧化应激的诱导和抑制研究

在Cytation™3细胞成像多模式阅读器中使用传统的微板检测和自动数字广角荧光显微镜，可以生成丰富的表型数据并快速筛选抑制剂

作者: Brad Larson和Peter Banks，应用部门，BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT;斯蒂芬妮·乔治奥,恩佐生命科学，法明代尔，纽约州

我们已经证明了一种利用荧光探针监测缺氧和氧化应激表型诱导的多重检测方法。数据读出可以通过使用单色仪或光谱过滤器测量的全井荧光强度来实现，用于描述相对表型变化的快速测量。通过使用自动数字宽视场荧光显微镜进行细胞分析，也可以获得每种表型受影响细胞的绝对比例。然后，我们在一个单独的实验中评估了抗氧化剂库的抗缺氧能力。利用全井强度快速筛选文库。仪器软件中的命中采集功能被激活，只对那些符合预定标准的井进行成像。然后成像提供了缺氧表型抑制程度的定性和定量评估。用发光细胞活力测定法发现，与对照相比，复合毒性引起过度抑制。所有基于细胞的检测均使用Cytation 3细胞成像多模式阅读器进行。

简介

缺氧是一种病理状态，整个身体或身体的一部分被剥夺了足够的氧气供应。氧浓度的变化可能是正常生理机能的一部分;例如在剧烈运动、高海拔攀登或深海潜水时。然而，缺氧也可能是一种严重的情况。许多过早出生的儿童经历广泛性缺氧，这是因为他们的肺还没有完全发育，含氧血液没有充分分布在全身。

皮肤缺氧损伤也是许多疾病的重要病理过程，包括压疮、糖尿病溃疡、静脉曲张溃疡等多种溃疡[1,2,3]。血液或氧气供应不足是主要原因，可导致慢性、不可愈合溃疡[4,5,6]。已有研究表明，氧化应激，即活性氧(ROS)的过度产生，与皮肤[7]的缺氧损伤密切相关。这导致了更多的研究，这些研究检查了抗氧化剂对缺氧的潜在保护能力及其下游影响。

在这篇应用笔记中，我们演示了一种体外多重微板试验，可以通过ROS的产生监测缺氧和氧化应激的诱导。氯化钴(col₂)，一种著名的缺氧模拟剂[9]，被用于化学诱导永生化角质形成细胞的这些表型。除了使用自动数字宽视野荧光显微镜外，还使用ppm基荧光微板检测获得了两种测定方法的相对全井荧光强度数据。的细胞分析特性提供了受影响细胞相对于总细胞群的定量比率Gen5软件除了定性视觉确认氧化应激和缺氧。

对记录的抗氧化化合物进行筛选，以确定是否可以使用包括在这里的细胞模型抑制缺氧条件的诱导。该仪器软件的命中选择功能允许使用整个井强度快速筛选化合物，然后仅对命中井成像，以收集表型数据。

然后进行剂量反应试验，以确认所选抑制剂化合物所产生的影响。最后，采用荧光细胞活力测定法，在检测到来自缺氧/氧化应激测定的荧光信号后，在同一孔中进行细胞活力测定。所有测量都在Cytation 3细胞成像多模式阅读器上进行。

材料与方法

材料

细胞

永久转化的角质形成细胞(目录编号:CRL-2309)来自美国类型文化收藏馆(ATCC)(马纳萨斯，弗吉尼亚州)。细胞在添加牛垂体提取物(目录编号13028-014)和EGF重组人蛋白(目录编号17005-042)的无角质形成细胞血清培养基中繁殖。PHG0311)来自Life Technologies (Carlsbad, CA)。

分析化学

缺氧/氧化应激检测试剂盒ENZ-51042-K100)由Enzo生命科学公司(Farmingdale, NY)捐赠。CellTiter-Glo®发光细胞活力测定法G7572)从Promega公司(Madison, WI)购买。双苯并齐胺H33342三盐酸盐(Hoechst 33342)(目录号14533)购于Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州)。

缺氧诱导物

六水氯化钴(目录编号:来自Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO)的C2911)被用于化学诱导角化细胞缺氧。

抑制剂

n -乙酰基- l-半胱氨酸(NAC)(目录编号;A7250)，购自西格玛-奥尔德里奇(圣路易斯，密苏里州)。Screen-Well®氧化还原库，V.1.1(目录编号:BML-2835-0100)由Enzo生命科学公司(Farmingdale, NY)捐赠。

细胞板

96孔平透明底，黑色PS, tc处理微板(目录编号3904)购于康宁生命科学公司(Corning, NY)。

仪表

细胞3细胞成像多模式阅读器

细胞分化3结合了自动数字广角显微镜和传统的微板检测。这项正在申请专利的设计提供了丰富的表型细胞信息和基于良好的定量数据。Cytation3配备BioTek的专利混合技术™用于微板检测，包括高灵敏度的基于过滤器的检测和灵活的基于单色仪的系统，具有无与伦比的多功能性和性能。可升级的自动化数字荧光显微镜模块为研究人员提供了丰富的细胞可视化分析，而不需要标准的基于微板的成像仪的复杂性和费用。

基于过滤器的系统用于检测氧化应激检测试剂的绿色荧光信号，设置如下:485/20 nm激励过滤器;528/20 nm发射滤波器;510nm截止镜;板块移动后延迟:100毫秒;读取高度:4.5毫米。以单色仪为基础的系统用于检测来自缺氧检测试剂的红色荧光信号，设置为:540 nm激发;605 nm发射;板块移动后延迟:100毫秒;读取高度:4.5毫米。

发光检测系统用于检测来自CellTiter-Glo®检测的发光信号，使用以下设置:平板移动后的延迟:100毫秒;整合时间:0.3秒;读取高度:4.5 mm。然后使用低氧/氧化应激多重试验和Hoescht 33342荧光探针使用显微镜功能进行20X成像。Gen5使用软件进行初始数据分析。

分析化学

缺氧/氧化应激检测试剂盒

Enzo生命科学公司(Farmingdale, NY)的缺氧/氧化应激检测试剂盒设计用于活细胞(悬浮液和贴壁细胞)中的缺氧和氧化应激水平的功能检测。该试剂盒包括用于缺氧(红色)和氧化应激水平(绿色)的荧光探针作为两个主要组成部分。红色缺氧探测探针是一种非荧光或弱荧光的芳香化合物，含有硝基(NO₂)的一部分。由于缺氧细胞中硝基还原酶活性的增加，硝基通过一系列化学步骤转化为羟氨基(NHOH)和氨基(NH)₂)组。然后原始分子降解释放荧光探针。氧化应激检测试剂是一种非荧光的，细胞渗透性的总ROS检测染料，它直接与广泛的反应物种发生反应，产生绿色荧光产物，表明细胞产生不同类型的ROS。

方法

试验协议

本文描述的分析方案是经过初始优化后建立的。角化细胞以1.0 × 105细胞/mL的浓度加入96孔细胞板，体积为100 μL，孵育过夜。对于激动剂方案，50 μL 3x氯化钴(col₂)然后添加到井中，在37°C/5% CO中培养₂在适当的时候。在抑制剂方案中，向井中加入25 μL的6x抑制剂，在37℃/5% CO下孵育60分钟₂．6x col 25 μL₂然后添加到井中，在相同的条件下孵育2小时。孵育后取出培养液，用100 μL的1倍PBS洗涤一次。将50 μL含缺氧、氧化应激和Hoechst 33342荧光探针的PBS加入孔中，在37°C/5% CO中培养₂30分钟。完成后，用100 μL PBS洗涤三次，最后在孔中加入50 μL PBS，然后进行平板读取和成像。

优化缺氧/活性氧刺激

进行了初步实验，以确定是否col₂可以在所使用的细胞模型中诱导缺氧，以及Cytation™3通过传统的微板检测，检测来自荧光探针的缺氧(红色)和氧化应激(绿色)荧光信号的能力。在第一个实验中，400 μM col₂(1x)加入细胞，在同样的条件下孵育30分钟至5小时。第二组是六种不同浓度的col₂加入0 ~ 1000 μM (1x)的细胞，在37℃/5% CO₂2个小时。在每次实验中，对所有井进行微板读取，并对各种[col₂s的剂量反应。

氧化还原复合文库筛选

然后评估84个成员氧化还原化合物库，以确定是否可以确定化学诱导缺氧的抑制剂。每种化合物的单井在最终浓度为10 μM的1倍浓度下进行测试。已知ROS清除剂NAC的四种个体浓度，以及无抑制阳性对照和无诱导阴性对照。最后的1倍浓度为500 μM col₂添加到测试井和阳性对照井中。

Gen5™Microplate Reader/Imager低氧抑制Hit Pick协议

使用Gen5软件创建了一个单独的协议，以便在复合库屏幕期间使用。该协议消除了对整个电池板成像的需要，因此避免了不必要的数据生成和存储。在Gen5中创建的板布局确定了控制井和测试井的位置(图1)。

图1所示。Enzo氧化还原复合文库屏幕的Gen5板布局。

Hit Pick程序要求使用缺氧测定读取参数读取板的所有孔(图2A)。

然后对RFU值比4口阳性对照井的平均值低一个标准差以上的井进行成像，即抑制作用大于或等于50%(图2B)。

图2。(A)点击选择microplate读取和成像程序。(B)使用Hit Pick程序标准成像的井。

选择复合抑制/细胞毒性分析

选择7个化合物加上NAC进行进一步分析，以确定每个化合物的完整抑制谱和细胞毒性潜力。测试了10种浓度的抑制剂，库化合物的浓度为0-100 μM, NAC的浓度为0-10 mM，加上库筛选中包含的无抑制阳性对照和无诱导阴性对照孔。最后的1倍浓度为500 μM col₂再次添加到测试井和阳性对照井中。细胞清洗和探针添加过程如前所述进行。在读取缺氧/氧化应激测试和20倍成像后，将等量(50 μL)的CellTiter-Glo®试剂添加到孔中。摇30秒，室温下孵育10分钟。然后从每个孔中检测发光信号，以评估细胞的活力。

结果与讨论

缺氧/氧化应激检测与优化

用400 μM的CoCl进行了第一次实验₂浓度和多次孵育时间(图3A)表明，col₂在此处使用的永生化角化细胞中诱导缺氧，与其他角化细胞模型[9]所显示的情况类似。此外，从氧化应激试验(图3B)中看到的δ RFU值的跟踪相似性证实了ROS的过量产生在细胞内缺氧条件的形成中所起的作用。我们还可以看到，2小时的孵育时间在两种试验中产生的荧光变化最大。

图3。400 μM col培养时间效应评价₂用于(A)缺氧和(B)氧化应激试验。

当col浓度变化时₂添加到角质形成细胞中并孵育2小时(图4)，显然，500 μM浓度虽然没有引起最大的RFU值变化，但仍对细胞造成了显著的缺氧效应。

图4。col的评价₂(A)缺氧和(B)氧化应激试验用2小时孵育的剂量反应。

当检查第二个实验中捕获的20x图像时，这也得到了定性验证(图5)。

图5。20x cyation™3组合图像的Hoechst 33342(蓝色)，缺氧(红色)和氧化应激(绿色)探针在2小时col后₂孵化。

图6。(A) Hoechst 33342细胞分析图像;(B)氧化应激;(C)缺氧染色细胞。分析参数包括阈值:10,000 RFU;最小物体尺寸:10 μm;最大物体尺寸:150 μm。(D)增加col的受影响细胞数与总细胞数之比₂浓度。

从microplate读取和20x成像结果，确定500 μM col₂浓度和2小时的孵育时间将用于后续的缺氧抑制剂实验，因为该浓度产生的孔荧光强度变化约15,000 RFU和约75%的细胞受影响。

Enzo Screen- well®氧化还原文库屏幕

筛孔氧化还原文库中含有许多已知的抗氧化化合物，对col的抑制进行了筛选₂induced-hypoxia。由于氧化应激和缺氧的两种表型密切相关，因此在筛选中只评估了缺氧。

许多抗氧化化合物被鉴定为能够抑制col₂如前所述，Gen5软件中的Hit Pick功能允许只包含“Hit”化合物的井和已识别的对照井的成像(图2B)，消除了不必要的数据创建和存储。其中一些化合物以及阳性对照化合物NAC进行了剂量反应试验，以确定其确切的抑制特性和潜在的细胞毒性作用。

图7。(A)筛孔氧化还原文库筛选抑制率从整个井微板读取计算结果，使用以下公式:(1-(RFU值(测试井)- RFU值(Neg Ctl))/(RFU值(Pos Ctl) - RFU值(Neg Ctl))))*100)。(B)使用Gen5中的Hit pick功能，从显示≥50%抑制且无复合控制的选定井中获得20张图像。

选择复合抑制/细胞毒性确认

使用每个测试浓度计算的百分比抑制值绘制了所选7个库化合物加上NAC的剂量响应曲线(图8)。从结果可以看出，在最高浓度下，每种化合物都能完全抑制缺氧。事实上，对一些测试的化合物观察到过度的抑制，如棉酚(图7B)。

图8。所选库抑制剂化合物和NAC的完整剂量响应曲线。

对角质形成细胞活力的影响也评估了整个复合剂量范围。

图9。(A)所选抑制化合物的%细胞活力值。(B)井中含有500 μM col也显示了20x图像₂加无抑制剂;(C)通过NAC抑制col₂诱导缺氧对细胞活力无影响;和(D)双硫仑抑制由于细胞活力的显著丧失。

从使用CellTiter- Glo®检测生成的细胞活力数据和捕获的20x图像来看(图9)，很明显，大多数测试的高浓度化合物对角质形成细胞具有显著的细胞毒性作用。因此，低氧实验中荧光信号的降低并不总是归因于对col的真正抑制₂诱导效应。

这些结果与之前发表的研究结果一致，表明外源性抗氧化剂在生理浓度下是有益的，但在高浓度[10]时可能会产生有害影响。

结论

缺氧/氧化应激检测试剂盒提供了一种易于使用的、基于多路细胞的方法，用于评估缺氧诱导和ROS生成。在添加了终点发光细胞活性试剂后，创建了一种三重方法，也允许检测潜在的细胞毒性。光路可以用来收集全阱的荧光和发光强度。在这项工作中，我们使用光谱滤波器对氧化应激表型进行定量分析，因为探针的光谱特征相当于荧光素，这是所有多模式读取器的标准过滤器集。探针对缺氧表型的光谱特性是非常不常见的，因此我们使用了这种染料的单色仪固有的波长灵活性和快速读取速度。最后，利用专用的发光检测系统对细胞活性试剂的信号进行量化。

这两个探针也可以与荧光显微镜一起使用。Cytation3的自动化数字广域荧光模块，除了Gen5软件的细胞分割功能外，还提供了丰富的表型数据，包括受表型影响的细胞的定性视觉确认和受表型影响的细胞相对于总细胞群的比例的绝对量化。

对于表型抑制的筛选，整个井的强度可以用于板的快速筛选，只有那些显示信号减少低于选定阈值的井需要成像，以确认命中和表型的量化。与一些较便宜的HCS仪器单独使用的数字广角显微镜相比，这大大加快了筛查速度，并缓解了数据存储问题。与典型的多模式阅读器相比，即那些没有自动数字荧光显微镜的阅读器，Cytation3提供了更丰富的表型数据和验证结果。

参考文献

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