结合一种新型的自动划痕工具和动态无标签成像来进行伤口愈合分析

作者:布拉德·拉森，安捷伦科技有限公司

摘要

伤口愈合或“划痕”试验是最常用的方法之一在体外监测和定量细胞集体迁移的方法。目前的标准涉及手工创面，创面之间的可重复性低，生成数据的可变性高，并且关于测试分子可能得出错误结论。使用自动化伤口创建工具，除了动态图像捕获和分析外，还可以轻松获得可重复的伤口和可靠且可重复的结果。

简介

当与邻近细胞相互作用时，细胞的运动，或称为集体细胞迁移，在许多关键的生理过程中发挥作用，包括形态发生和组织再生。¹这种类型的运动作为一个有凝聚力的群体也被证明在伤口愈合和癌症转移中至关重要。在伤口愈合过程中，上皮细胞作为一层细胞集体迁移。上皮层损伤诱导细胞定向迁移。在此过程中，细胞保持紧密的细胞间粘附，愈合原始伤口。²同样，集体细胞迁移也被认为在癌症转移中起着重要作用。越来越多的文献表明，转移性细胞聚集并集体侵入癌症患者的血管和淋巴系统。^{3 - 4}因此，更好地了解集体细胞运动对多种疾病类型的治疗具有重要价值。

最广泛使用的测量集体细胞迁移的方法之一是伤口愈合或“划痕”试验。在融合细胞层内创建伤口或无细胞区后，使用细胞成像随时间监测细胞返回伤口区域的运动。动力学和终点数据然后允许定量细胞迁移，无论是在未抑制或在测试分子的影响下。对于创口，通常是手动将移液管尖端穿过细胞，这可能导致创口在宽度、方向和孔内位置上发生巨大变化。这增加了重复孔内和不同滴定时计算测量值的变异性，使关于测试细胞模型和处理的迁移能力的最终结论复杂化，特别是在比较测定法与测定法数据时。为了增加生成数据的健壮性，有必要使用一种方法来创建一致的伤口。

这项研究展示了使用一种新型的自动化工具在微孔板底部形成的细胞单层中创建划痕。只需按一下按钮，使用4针或8针头，即可在24孔或96孔板上产生相同大小和面积的划痕。该工具的甲板上还安装了一个多储层清洗槽。使用机载编程程序，在使用前后完成每个引脚的无人值机清洗和去污。占地面积小，可以插入工具;使用任何尺寸的层流罩，以无菌方式产生伤口。清洗后，板可以转移到安捷伦BioTek自动成像仪或安捷伦BioSpa活细胞分析系统，以动态监测细胞迁移。2022世界杯附加赛决赛

材料与方法

材料

细胞

HT-1080纤维肉瘤细胞(部件号cc -121)购自ATCC (Manassas, VA)。表达RFP的人新生儿真皮成纤维细胞(部分编号cAP-0008RFP)购自angioo - proteomie (Boston, MA)。表达GFP的U-87胶质母细胞瘤细胞由Sachin Katyal博士(University of Manitoba, Winnipeg, Manitoba, Canada)慷慨捐赠。

实验组件

高级DMEM(部件号12491- 015)、胎牛血清(部件号10437-036)、青霉素-链霉菌素胺(100x)(部件号10378-016)、TrypLE表达酶(1x)、酚红(部件号12605-010)、Alconox粉末精密清洁剂(部件号16-000-104)、vircon -s(部件号NC9821357)和CellTracker绿色CMFDA染料(部件号C2925)均购自赛默飞仕科学公司(沃尔瑟姆，马萨诸塞州)。Cytochalasin D(零件号1233)购自Bio-Techne Corporation (Minneapolis, MN)。24孔透明tc处理多孔板(零件号3524)和96孔透明、平底聚苯乙烯tc处理微孔板(零件号3598)购自康宁生命科学公司(康宁，纽约)。

2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek AutoScratch创面制作工具

安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek AutoScratch创面制造工具在微板中生长的细胞单层中自动创建可复制的创面。简单的按钮操作和无需工具的划痕针歧管交换使其易于处理96孔或24孔板，这些板通常用于迁移和入侵分析。紧凑的系统具有机载，预编程的清洁程序，以保持划痕针无堆积，避免污染。AutoScratch通过安捷伦BioTek Cytation细胞成像多模式阅读器和安捷伦BioTek Lionheart自动显微镜精确有效地自动化了成像工作流程的样品准备。2022足球世界杯预测2022世界杯附加赛决赛

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Cytation 5是一种模块化的多模微孔板阅读器，结合自动化数码显微镜。可使用基于滤镜和单色仪的微孔板读数，显微镜模块提供高达60倍的荧光放大倍数，亮场，彩色亮场和相位对比度。该仪器可以在一个步骤中进行多达四个通道的荧光成像。特别强调活细胞分析，Cytation 5具有震动，温度控制到65°C, CO₂/ O₂用于动力学分析的气体控制和双注射器，并由集成的安捷伦BioTek Gen5微孔板读取器和成像仪软件控制，该软件还可以自动进行图像捕获、分析和处理。2022世界杯附加赛决赛该仪器用于在潜伏期捕获动态高对比度亮场和荧光图像。

2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek BioSpa 8自动化培养箱

BioSpa 8自动化培养箱将安捷伦BioTek读取器或成象器与安捷伦BioT2022世界杯附加赛决赛ek清洗机和分配器连接在一起，可实现多达8个微板的完整工作流程自动化。温度、有限公司₂/ O₂湿度水平通过安捷伦BioTek BioSpa软件进行控制和监测，在所有实验阶段保持细胞培养的理想环境。2022世界杯附加赛决赛测试板在BioSpa中孵育，以在孵育期间保持适当的大气条件，并自动转移到Cytation 5中进行高对比度亮场和荧光成像。

2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek MultiFlo FX多模式分配器

MultiFlo FX是一种模块化，可升级的试剂分配器，可以有多达两个环泵(8管分配器)，两个注射泵分配器和一个带垫圈。注射器和清洗管汇可以配置为板密度从6- 384井。

方法

细胞的准备

细胞在T-75烧瓶中培养至80%合流。使用TrypLE从烧瓶中分离后，根据平板孔密度和培养条件，将细胞重新悬浮到预先优化的浓度(表1)。
自动划痕清洗程序

在测试板中创建缠绕之前，对AutoScratch工具引脚进行清洁和消毒。将四种清洗组分添加到清洗槽的单个储层中，并标记以辅助添加适当的组分和体积(表2)。
按下“清洁”按钮开始清洁程序。在此过程中，包含销钉的刮划臂从原位移动到含有0.5% Alconox的储液中，在y轴上搅拌3秒，然后将销钉浸泡在组件中5分钟。在5分钟的潜伏期结束后，手臂将引脚移动到Virkon-S上。然后对每个剩余组件自动重复该过程。在20分钟的清洗周期结束时，针被清洗、消毒，并准备用于创面。

划伤创口

清洗程序完成后，测试板被添加到AutoScratch工具的甲板上，盖子被移除。按下与所用微孔板密度“24”或“96”相适应的“划痕”按钮，开始切割过程。在这里，手臂将销从主位置移动到板的第一列，在那里在孔的中心垂直地做了一个划痕。然后，臂将引脚移回包含DI H2 O的储层，并执行3秒的搅拌以去除粘在引脚上的任何移位细胞。然后将销钉移到第2列，对板的每一列重复划痕和清洗步骤。

划痕后洗版

创口创建程序完成后，将钢板转移到包含安捷伦BioTek MultiFlo FX的单独层流罩中。2022世界杯附加赛决赛在这里进行了洗板程序，以去除从板的底部移出的细胞。之前用70%乙醇消毒的洗带机的不锈钢管被用来抽吸介质，而蠕动泵和一个高压灭菌的5 uL盒式容器将新鲜介质分配回来。对于未被抑制的井，该过程重复3次。对于含有细胞松弛素D滴定的孔，在第三个吸入循环后手动添加含有抑制剂的培养基。

基于动态图像的细胞迁移监测

然后将平板放置在BioSpa 8中，大气条件预先设置为37°C/5% CO₂．向锅中加水以创造一个潮湿的环境。BioSpa 8软件的编程使平板自动转移到Cytation 5进行高对比度亮场或高对比度亮场和荧光成像，这取决于合并的细胞类型。每个通道都拍摄一张4倍图像(表3)，以捕捉细胞进入原始伤口区域的潜在运动。

表3。包括每个测试细胞模型的成像通道。

然后盘子被转移回BioSpa 8。根据每个细胞模型的迁移速度，使用优化的迭代进行动力学成像周期(表4)。

表4。优化每个细胞模型的成像间隔。

图像处理

捕获后，使用表5中的设置，处理高对比度的亮场图像，以增加图像的背景和包含细胞区域之间的亮场信号对比度，同时处理荧光图像，以去除背景信号。

表5．图像预处理参数。

预处理图像的细胞分析

对处理后的图像进行细胞分析，使用表6中的标准量化每张图像中包含区域的细胞。

表6．对象掩码分析参数。

伤口愈合度量计算

然后使用动能细胞面积覆盖值(物体总和面积)生成三个额外的伤口愈合指标，包括伤口宽度、伤口合流和最大伤口愈合率。每个指标都由安捷伦BioTek Gen5伤口愈合协议自动计算。2022世界杯附加赛决赛

伤口宽度

缠绕宽度，或无细胞区随时间的平均宽度，使用以下公式计算:

其中W_t随时间的平均缠绕宽度(μm)， I_一个是4倍图像的总面积，物体和面积_t是每个时间点细胞覆盖的面积，I_H是一个4倍图像的高度。

伤口融合

伤口合流，或随着时间的推移，迁移细胞覆盖原始伤口面积的百分比，使用以下公式计算:

C_t=物体和面积_t-物体求和区域₀* 100
我_一个-物体求和区域₀

其中C_t伤口合流百分比随时间的变化，物体和面积_t是每个时间点单元格覆盖的面积，物体和面积₀是时间0时细胞覆盖的面积，I_一个是4倍图像的总面积。

最大伤口愈合率

最大伤口愈合率是在第5代中使用动力学分析步骤计算的。选择Max V计算类型，并使用和面积曲线上的六个数据点计算速率。表示为μm²每小时。

结果和讨论

划痕创面一致性的验证

为了验证AutoScratch单元创建一致大小伤口的能力，HT-1080细胞被镀到96孔微板的每孔中，使用100 μL的体积和4.0 × 10的浓度⁵细胞/毫升。在经过一夜的孵育以使其能够附着后，将这些钢板逐个放置在甲板上，然后用AutoScratch工具在每口井上进行划伤。通过对高对比度亮场图像的目视检查，每口井的伤口形状和大小都是一致的(图1)。

图1．使用安捷伦BioTek AutoScratch，使用高对比度亮场成像通道和4倍物镜，在创面后立即从96孔板中捕获图像。2022世界杯附加赛决赛

在24孔板中也进行了一致的创面验证。在这里，HT-1080细胞加入到每个孔中，体积为1ml，浓度为2.4 × 10⁵细胞/毫升。在一夜的细胞附着潜伏期之后，这些平板再次被放置在甲板上，并用Agilent BioTek AutoScratch工具进行划痕。2022世界杯附加赛决赛视觉检查从24孔板捕获的高对比度亮场图像再次显示了一致的伤口形状和大小，与从96孔板中看到的相似(图2)。

图2。使用安捷伦BioTek AutoScratch，使用高对比度亮场成像通道和4倍物镜，在创面后立即从24孔板上捕获图像。2022世界杯附加赛决赛

为了量化创面形成的一致性，使用表5中描述的参数对高对比度亮场图像(图3A)进行预处理。使用该方法，增加了包含单元格的图像区域与背景之间的对比度(图3B)。这允许使用表6中的细胞分析标准在包含细胞的区域(图3C)周围精确地放置对象掩码。

图3。高对比度亮场图像处理与分析。(A)高对比度明场原始图像;(B)预处理高对比度明场图像;(C)预处理的高对比度明场图像与目标掩模放置。

使用前面描述的创面宽度公式，生成了96孔板和24孔板的每一孔创面后0时刻的平均创面宽度。在96井测试板的所有井中，绕线宽度的CV为2.1%，而在24井测试板中，绕线宽度的CV为1.4%，这表明在使用AutoScratch工具时，无论使用任何一种井密度，创面尺寸的重复性都很高。

细胞转移测试

由于创口是在微孔板上以列的方式产生的，因此有必要确认在每个列中创口之后的清洗过程有效地呈现了携带和交叉污染(细胞没有在AutoScratch工具的引脚上从一列携带到另一列)。在本实验中，用CellTracker Green荧光探针对96孔板第1柱中的HT-1080细胞进行染色，而第2至12柱中的所有其他孔均未染色(图4)。

图4。高对比度亮场和GFP图像。(A)高对比度亮场/GFP叠加图像;(B)第1列中CellTracker绿色染色细胞创面后的GFP图像。(C)高对比度亮场/GFP叠加图像;(D)第2列未染色细胞创面后的GFP图像。

然后允许创口按照前面描述的那样进行。图像处理后，对图像进行分析，量化每张图像的GFP信号总量。然后计算第2列到第12列中与第1列中的信号相比的每一行的GFP信号百分比。

图5。计算第1列中染色细胞的GFP信号携带值百分比。

从图5可以看出，在柱1之后的每一个孔中，信号百分比都小于0.1%，说明每一柱击伤后的清洗过程有效地防止了细胞在柱间的携带，消除了结转和交叉污染(每个测试板柱间的结转和交叉污染)。

动态伤口愈合指标

然后允许对测试板进行动态成像，以监测细胞迁移到伤口区域。测试板被添加到BioSpa 8中，并以预定的时间间隔自动转移到Cytation 5中。由于HT-1080细胞迁移迅速，因此选择更频繁的60分钟成像间隔来正确捕捉细胞随时间的移动。与伤口宽度度量一样，总和面积值用于计算整个潜伏期内每口井的伤口合流。每种板类型的所有指标，包括原始面积总和值、计算的伤口宽度和伤口汇流，然后通过比较每口井的动力学曲线来评估数据的一致性(图6)。

动力学和面积图也用于计算最终的动力学伤口愈合指标，最大伤口愈合率。通过检查每个指标生成的动力学曲线，很明显，井与井之间存在高度的相似性。此外,最大的伤口愈合率值的平均每个96 -或24-well盘子,在95%置信区间为1.61±0.01×105µ平方米/小时% 96 - 3.8%的简历,和1.612±0.005×105µ平方米/小时的2.1% %的简历24-well格式,确认使用AutoScratch工具的收益率动能伤口愈合结果与高水平的一致性的井内一个板,和也不同板块之间的格式。

图6。绘制动态伤口愈合度量数据的全板截图。分别为(A.， C.，和E.) 96孔板和(B.， D.，和F.) 24孔板的运动和面积，创面宽度和创面汇流图。

细胞迁移抑制分析

AutoScratch工具也用于准备伤口愈合抑制测试。这里的自动伤害和清洗程序是按照前面描述的那样进行的。然而，在这种情况下，在第三个洗涤吸入步骤之后，将含有不同浓度的细胞松弛素D的培养基添加到孔中。在96孔板上添加12个重复的8点滴定，在24孔板上添加4个重复的6点滴定。测试板再次添加到BioSpa™8中，并按照之前的定义自动成像。动力学迁移曲线显示了在每种抑制剂浓度下复制之间取得的一致性(图7)。

图7。动态细胞松弛素D滴定创面汇流图。(A) 96孔板包含12个重复的8点滴定。细胞松弛素D从1万nM开始，从A-G行连续1:4稀释，H行为无复合阴性对照。(b) 24孔板包含4个重复的6点滴定。细胞松弛素D从10000 nM滴定，从柱1-5连续1:10稀释，柱6为无复合阴性对照。

然后将每个测试浓度的平均动力学曲线绘制在96井或24井格式的数据图上(图8)。

图8．平均动力学细胞松弛素D滴定创面汇流图。在(a) 96孔中每个捕获时间点的每个测试细胞松弛素D浓度的平均值，正负标准偏差;和(b) 24孔板格式。

在观察单个的动力学曲线后，就有可能看到随着时间的推移，化合物滴定的总效果。在比较IC时，能够在整个潜伏期收集图像并生成动力学数据，而不是在预先决定的时间执行端点成像的优势变得明显₅₀各个潜伏期产生的曲线和值(图9)。

图9。不同孵育期细胞松弛素D剂量反应图。剂量反应曲线和产生的IC₅₀HT-1080细胞与细胞松弛素D孵育5、10、15或20小时后(a) 96孔的值;和(b) 24孔板格式。

从96孔或24孔实验产生的5小时孵育剂量响应曲线来看，在阴性对照和低复合处理孔中，细胞迁移显然是不完全的。因此计算IC₅₀数值不能正确反映化合物抑制细胞迁移的能力。通过将潜伏期再延长5小时，显然含有少量或不含化合物的井可实现完全伤口闭合。最高浓度也可达到完全抑制，产生完全剂量反应和更准确的IC₅₀价值。当使用15小时潜伏期时，等效剂量反应曲线和IC₅₀值也可以看到。然而，如果允许细胞迁移20小时，剂量反应曲线形状发生显著变化，IC₅₀与10小时和15小时的潜伏期相比，数值增加了2.5- 3.5倍。通过使用来自完整数据集的信息，可以为未来的实验决定10-15小时之间的适当潜伏期。

手工划伤创口

创口也使用P200移液管尖端在96孔格式中手动进行，以比较使用通常合并的手动方法获得的结果AutoScratch工具。

从图10中的图像来看，每个创口内的可变性明显大于AutoScratch。图10A和B中的图像显示，图像顶部的伤口宽度较大，而接近图像底部的伤口明显较小。即使当伤口在图像下方具有更一致的宽度时(图10C)，垂直度的缺乏也会使生成的结果偏斜。从48口井中使用Gen5™生成的伤口宽度计算的%CV可以明显看出这一点，这些伤口都是手工制造的。9.2%的最终值大于使用AutoScratch在96孔板上创建伤口时的4倍(2.1%)，大于使用AutoScratch在24孔板上创建伤口时的6倍。

图10。用P200移液管尖端使用高对比度亮场成像通道和4倍物镜在创面后立即从96孔板上捕获图像。

通过动态细胞迁移数据生成的细胞松弛素D剂量反应曲线(图11)，可以进一步说明手工创面板与AutoScratch创面板之间数据质量的差异。

图11。Manual和Agil2022世界杯附加赛决赛ent BioTek AutoScratch细胞松弛素D剂量反应图。剂量反应曲线和产生的IC₅₀将HT-1080细胞与细胞松弛素D孵育10小时后，在96孔板中手动划痕或用AutoScratch工具划痕后的值。

当使用相同的复合潜伏期时，曲线形状缺乏用AutoScratch创建的伤口和IC所见的乙形剂量反应₅₀值是5倍，这可能导致在人工损伤过程中对测试分子的效力做出错误的假设。

使用可变大小的细胞模型创建AutoScratch伤口

由于各种各样的细胞模型被纳入2D划伤愈合分析，AutoScratch工具也被用于使用原代成纤维细胞和U-87胶质母细胞瘤细胞创建伤口，与HT-1080细胞相比，它们具有更大的尺寸和不同的板附着模式。由于Cytation 5可以使用高对比度亮场和荧光捕获图像，表达RFP的成纤维细胞和表达GFP的U-87细胞可以使用高对比度亮场和来自细胞的RFP或GFP信号在单个成像步骤中捕获(图12)。

图12。原发成纤维细胞和U-87胶质母细胞瘤细胞的高对比度亮场和荧光图像。(A)高对比度亮场;(B)表达原代成纤维细胞的RFP图像。(C)高对比度亮场;(D)表达GFP的U-87细胞的GFP图像。

利用96孔成纤维细胞(3.2%)和24孔U-87细胞(2.6%)的高对比度亮场图像，从时间0时产生的伤口宽度计算出的百分比CV值表明，尽管细胞模型形状不规则，AutoScratch工具可以在每个孔中创建一致的伤口。

细胞松弛素D处理成纤维细胞或U-87细胞后的动态伤口愈合抑制曲线(图13)与使用HT-1080细胞所见的图8曲线相比，也证明了Gen5细胞分析指标可以在不同大小和形状的细胞周围放置精确的物体面具。

图13。平均成纤维细胞和U-87动力学细胞松弛素D滴定创面汇合图。(a)原代成纤维细胞在每个捕获时间点上的每个测试细胞松弛素D浓度的平均正负标准偏差;或(b)u - 87细胞。

结论

安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek AutoScratch创口制作工具以自动方式在96孔和24孔板格式中创建一致的创口。除了在柱间移除细胞外，切割前后的消毒和灭菌程序简化了工具的清洁，还防止细胞在柱间转移。与手工创面板生成的结果相比，创面初始宽度和动力学值显示出改进的可重复性和增强的稳健性。自动创面生成程序、动态成像和安捷伦BioTek Gen5细胞分析方法相结合，创建了一个易于使用、可靠的过程来进行创面愈合分析。2022世界杯附加赛决赛

参考文献

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