温度升高对LAMP检测性能的改善

作者: Paul Held，博士，安捷伦科技公司

摘要

环介导等温扩增(LAMP)是一种自动循环和链位移的DNA合成扩增方法，涉及到使用的大片段BstDNA聚合酶。虽然通常在65°C的均匀温度下进行，但当运行这种检测技术时，使用升高的温度有一定的优势。本应用笔记描述了安捷伦BioTek的使用2022世界杯附加赛决赛协同H1反应温度为69°C的多模式读取器，以减少诱导阳性LAMP检测反应所需的时间。

简介

环介导等温扩增(LAMP)是一种检测技术，它能够在几种不同的条件下检测核酸序列，而不需要热循环器。LAMP是一种链位移DNA合成扩增方法BstDNA聚合酶，结合4到6个引物识别目标DNA的多个不同区域，进行高度特异性的扩增反应。¹一个链取代DNA聚合酶启动合成，两个特殊设计的引物形成“环”结构，通过在环上的延伸和引物的额外退火，促进后续的扩增。产物通常乐鱼平台入口相当长(> 20 kb)和可变，由短目标序列的多次重复形成。目标扩增是如此广泛，多种不同的检测模式是可能的，包括荧光和吸收。一种常用的检测方法是在低缓冲条件下pH依赖染料的颜色变化，因为聚合反应引起明显的pH变化。⁴虽然在DNA检测方面，荧光通常比吸光度更灵敏，但这种方法允许在没有插入DNA序列的试剂的情况下快速检测阳性反应。此外，放大的程度通常非常广泛，因此不需要荧光技术。

LAMP分析反应依赖于设计引物对其互补目标序列的忠实退火。引物设计包括引物长度、鸟嘌呤-胞嘧啶含量和独特的靶序列对反应保真度起着关键作用。使用5 '尾作为引物设计的一部分(对LAMP分析至关重要)也提高了引物延伸反应的保真度。⁶此外，基于离子强度和反应混合物温度的退火过程的严格程度也同样重要。⁵而改变LAMP测定法离子强度的能力受到Bst酶的要求，可以用反应温度来提高严格度。利用初始LAMP反应Bst大片段聚合酶。对野生型酶的修饰(Bst2.0和Bst3.0)提高LAMP性能。这三种聚合酶都是中等耐热的DNA聚合酶，具有链置换活性，可以进行LAMP等等温扩增反应。

然而,Bst2.0 DNA聚合酶是硅设计的同源物BstDNA聚合酶，大片段工程，以改善扩增反应的性质。Bst3.0的特点是扩增速度、抑制剂耐受性、热稳定性和dUTP掺入进一步提高。Bst3.0的逆转录酶活性在72°C时也显著提高，可用于单酶RTLAMP反应。⁷

实验

比色LAMP反应在最终反应体积为5 μL的条件下进行。LAMP检测试剂盒组分(p/n E2019S)的浓度，来自New England Biolabs (Ipswich, MA)，按照制造商说明使用。样品、引物、盐酸胍、核酸游离水和模板在Eppendorf管中预混合，总体积为60µL，然后分成两个25µL的部分，置于冰上保存。在实验开始前，将25µL的2x Softstart Master mix添加到一部分实验样品中，如图1所示。混合后，5µL等分物(8个重复)转移到来自康宁(Corning, NY)的透明底、黑面384孔板(p/n 3542)，用来自Greiner Bio-One North America Inc. (Monroe, NC)的qPCR密封剂(p/n 676040)密封，在300 g的浓度下离心1分钟。离心后，将微板置于Agilent BioTek Synergy H1多模读入器中，读入器预热至65℃，梯度为2022世界杯附加赛决赛1℃，通过Synergy H1上的波长开关，每1.5分钟读取420 nm和560 nm的吸光度。在65°C反应完成后，温度升高到69°C，梯度为1°C，预热20分钟。样品的第二部分使用相同的读数参数进行分析，而不是温度。当420:560比为1.1或更高时，阳性反应被指定。在这个比例下，反应的pH值先前已被证明超过7.5。⁸

图1所示。灯分析设置。

结果与讨论

Synergy H1可以保持高精确度的高温。如图2所示，LAMP测试在65℃或69℃下运行，在整个动力学测试过程中保持选定的温度。从环境温度到65°C需要60分钟。当温度上升到选定的温度时，热敏电阻被调制以避免超过目标(数据未显示)。在这一点上，平衡已经实现，化验可以运行。

图2。LAMP测定的温度分布为65℃和69℃。在LAMP试验动力学过程中，记录每个吸光度测定周期的温度。实线表示记录的温度数据，虚线表示井与井之间的差异规格。

使用稍微升高的温度可以提高检测响应时间，如图3所示。阳性对照比相同样品在65°C下运行提前3.5分钟达到截止标准。在样品达到聚合酶活跃的温度后，扩增几乎立即开始。在建立测定时，为了防止假聚合，样品保存在冰上。此外，微板通常是在室温环境下。只有当样品板放入微版阅读器中并加热到接近65°C时，底漆才会正确退火Bst酶聚合DNA产物。无论使用什么温度，阴性对照都没有显著改变420:560的吸光度。

图3．比较动力学LAMP测定结果在65℃和69℃下运行。来自阳性和阴性对照样本的LAMP分析分别在65或69°C和1°C的上下梯度下进行，以防止凝结。测定各时间点在420和560 nm处的吸光度，并绘制成一个比值。实线表示420:560的比率为1.1，这被指定为阳性结果。还指出了达到420:560比例为1.1所需的时间。数据表示8种测定方法的平均值和标准差。

当稀释已知目标拷贝数的阳性样本时，随着目标拷贝数的减少，达到420:560大于1.1的比例所需时间增加，如图3所示。与未稀释阳性对照观察到的数据相似，在高温下运行LAMP试验减少了达到阈值的时间。

图4。LAMP测定在65℃和69℃下开始时间结果的比较。使用阳性对照的LAMP试验在65和69°C连续稀释。将达到420:560吸光度比所需的时间记录下来，并绘制成起始目标拷贝数的函数。每个数据点代表八个独立测定的平均值和标准差。

这些数据表明，使用高于65℃的温度可以提高LAMP检测的性能。升高的温度增加了反应的退火严格程度，从而减少了发生假的非特异性反应的可能性。LAMP与PCR不同，它不会产生可以用凝胶电泳检测的明确的聚合产物。乐鱼平台入口这种检测技术依赖于大量的聚合反应来引起反应管中可见的变化。因此，假阳性反应可能会有问题。利用反应温度来增加反应的严格程度是缓解这一潜在问题的一种方法。除了提高检测的严格程度，较高的反应温度也能使反应更快地升温。在测定建立过程中，反应组分和样品通常在冰上保存;只有在反应混合物完成后，才将微板离心并置于阅读器的培养箱中。只有这样，反应才会足够热烈Bst聚合酶酶具有活性。如图3和图4所示，这可以减少阳性样本达到阳性阈值所需的时间。

结论

安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek Synergy H1多模式读取器具有扩展的温度范围包，是在65°C以上温度下运行LAMP检测的可行选择。Synergy H1在微板上方和下方使用加热器，配合多个热敏电阻提供稳定、均匀的高温培养，最高可达70°C。将温度从65°C增加到69°C增加了退火的严格程度，并减少了正向反应达到阈值所需的时间。

参考文献

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