基于图像，无标签的方法检测和量化一般和定向T细胞激活

作者:布拉德·拉尔森，安捷伦科技公司；Wini Luty和Courtney Noah，BioreclamationIVT，奥利弗Donze，AdipoGen生命科学，;Glauco R. Souza，德克萨斯大学健康科学中心休斯敦分校而且Nano3D生物科学公司

摘要

T细胞激活是靶向免疫反应必不可少的初始步骤在活的有机体内．T细胞的体外激活导致细胞增殖和细胞聚集的形成，使用无标记成像和分析进行跟踪。将T细胞在抗体和工程细胞因子IL-2存在下的一般激活率与T细胞暴露于靶细胞球体下的定向激活率进行比较。

简介

T细胞对适应性免疫系统至关重要，因为它们能识别并摧毁致病细胞，而不伤害健康细胞。记忆能力使T细胞能够在较长时间内产生有效和有针对性的免疫反应。因此，它们是抗肿瘤单克隆抗体、癌症疫苗、过继T细胞转移和检查点阻断等新型癌症疗法的一个有前途的重点。¹这些T细胞免疫疗法的关键过程是T细胞的定向激活和扩增。Naïve当T细胞在其T细胞受体(TCR)具有高亲和力的细胞表面遇到mhc肽复合物时，T细胞被激活。除了产生信号级联外，蛋白质受体如CD28提供了必要的共刺激信号，它们与抗原提呈细胞相互作用。这会刺激细胞因子的表达，包括IL-2，它是T细胞扩张的关键生长因子。当T细胞被激活时，它们在孔内形成同型聚集体，增殖率增加。²

当培养在体外在这种情况下，T细胞通过加入抗原(通常是IL- 2)而被激活。然而，为了加强反应通过定向激活，并更好地模仿在活的有机体内T细胞可以在目标细胞的存在下培养，目标细胞分泌多种可溶性因子，包括上述的细胞因子，以增加T细胞的增殖^3.并使T细胞增敏，以增强它们在细胞介导的细胞毒性应用中寻找目标癌细胞的能力。然而，在二维单分子层培养的靶细胞缺乏细胞:细胞和细胞:基质的通讯、代谢梯度和极性在活的有机体内⁴．三维(3D)细胞培养方法创造的环境和通信网络类似于在体内看到的，可以适当地刺激T细胞。

在这里，我们展示了使用无标签成像方法和细胞分析跟踪和量化一般和定向T细胞激活的能力。在一般方法中，使用抗cd3和抗cd28抗体激活T细胞，这模拟了抗原提呈细胞和不同浓度的工程IL-2细胞因子的刺激。定向T细胞激活使用T细胞、抗体和工程IL-2以及3D生物打印目标球体。在这种方法中，目标细胞被生物兼容的纳米颗粒组件磁化，该组件由金、氧化铁和聚l -赖氨酸组成，可静电和非特异性地附着在细胞膜上。然后，用弱磁力引导磁化的细胞形成聚集体，在那里细胞相互作用，并与代表原生组织的细胞外基质(ECM)建立更大的3D环境。然后这些球状体与T细胞和井中的其他成分自发地相互作用。在这两种方法中，细胞成像和分析都使用了一种新型细胞成像多模式阅读器。细胞保存在37°C/ 5% CO的潮湿环境中₂环境采用自动培养箱，并定期转移到成像仪上。在6天的时间内监测增殖率和细胞聚集作为T细胞激活的指标。

材料与方法

材料

细胞和培养基

MDA-MB-231上皮乳腺腺癌细胞(部分号HTB-26)从ATCC (Manassas, VA)中获得。稳定表达RFP(部分号cAP-0008RFP)的人新生儿皮肤成纤维细胞从Angio-Proteomie (Boston, MA)购买。人类纯化的CD3+ T细胞，通过负选择从外周血单个核细胞中分离出来(部分编号为HM-PBMC-TCELLCD3-M)，由BioreclamationIVT (Westbury, NY)捐赠。高级DMEM(部件编号12491-015)、RPMI 1640培养基(部件编号11875-093)、胎牛血清(部件编号10437-036)和青霉素-链霉素卢他明(100X)(部件编号10378-016)从赛默飞世尔科学公司(沃尔瑟姆，MA)购买。

分析和实验成分

IL-2 Superkine (Fc)(零件号AG-40B-0111-C010)，抗cd3(人类)，单克隆抗体(UCHT1)(零件号acc -144-020)和抗cd28(人类)，单克隆抗体(ANC28.1/5D10)(零件号acc -177-020)由AdipoGen生命科学公司(San Diego, CA)捐赠。CELLSTAR透明细胞培养24孔细胞排斥微板(GBO部件号662970)和384孔生物检测试剂盒(GBO部件号781846，包括2瓶NanoShuttle-PL, 6孔悬浮磁铁驱动，384孔球形和保持磁铁驱动(2)，96孔深井混合板，6孔和384孔透明细胞排斥表面微板)，原型384孔环驱动和额外的细胞排斥表面6孔(GBO部件号657860)，由Nano3D生物科学公司捐赠。和Greiner Bio-One, Inc. (Monroe, NC)。

2022世界杯南美区预选赛

Cytation 5是一种结合自动化数字显微镜的模块化多模微板阅读器。基于滤镜和单色仪的微板读数可用，显微镜模块提供高达60倍放大的荧光，亮场，彩色亮场和相位对比。该仪器可以在一个步骤中进行多达四个通道的荧光成像。特别强调活细胞测定，Cytation 5具有震动，温度控制到65°C, CO₂/ O₂气体控制和双注射动力学分析，并由集成的安捷伦BioTek Gen5微板阅读器和成像软件控制，该软件还可以自动图像捕获、分析和处理。2022世界杯附加赛决赛该仪器使用亮场通道动态监测T细胞活性超过7天。

2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek BioSpa 8全自动培养箱

BioSpa 8自动化培养箱将安捷伦BioTek阅读器或成像仪与安捷伦BioT2022世界杯附加赛决赛ek洗衣机和分配器连接起来，可实现多达8个微板的完整工作流程自动化。温度、有限公司₂/ O₂，通过安捷伦BioTek BioSpa软件控制和监测湿度水平，在所有实验阶段保持细胞培养的理想环境。2022世界杯附加赛决赛测试板在BioSpa中孵育，并在指定的时间点自动转移到Cytation 5以监测T细胞激活。

方法

一般T细胞活化

CD3+ T细胞根据制造商的建议进行解冻和制备。然后将细胞在RPMI 1640完全培养基中稀释至10万细胞/mL或50万细胞/mL，培养基中分别含有250 ng/mL的抗cd3和抗cd28抗体，此外IL-2 Superkine浓度为100 - 0 ng/mL。在24孔细胞排斥微板的孔中加入1 mL不同测试条件的体积。然后将培养皿放入BioSpa中，在37ºC/5% CO下孵育6天₂．BioSpa是预先编程的，每6小时，板自动送到Cytation 5，在那里使用12行10列蒙太奇捕获4倍的亮场图像。在72小时的培养后，BioSpa暂停，人工取出培养皿，转移到无菌组织培养罩中。用人工抽吸法慢慢去除用过的培养基，用含有与最初添加的相同浓度的IL-2 Superkine和抗体的新鲜培养基代替。然后，盘子被转移回生物水疗中心，并继续了72小时的跑步。

三维靶细胞制备

将MDA-MB-231或成纤维细胞培养物在T-75烧瓶中培养至80%汇合，然后如图1所示，用600 μL NanoShuttle-PL在37°C/5% CO处理过夜₂．孵育后，细胞胰蛋白酶化，洗涤，在37°C/5% CO孵育3 - 5分钟₂．从烧瓶中取出细胞，以1.2 × 106细胞/孔的浓度添加到6孔细胞驱避板上。将6孔磁铁驱动器放置在孔板上，悬浮细胞，在37°C/5% CO孵育8小时，细胞聚集和ECM形成₂．孵育后，细胞和ECM被打碎并重新悬浮在完全先进的DMEM培养基中，准备在24孔板中进行生物打印球体(图1)。

图1所示。定向T细胞激活靶细胞的制备。

定向T细胞激活

在24孔细胞驱避板孔中加入10000个靶细胞和培养基，每个实验条件如下:(A) 100% MDA-MB-231;(B) 75% MDA-MB-231和25%成纤维细胞;(C) 50% MDAMB- 231和50%成纤维细胞;(D)没有细胞。最后的测试条件包括只有(E)介质的井。在每种测试条件下，井的总容积为1ml。然后将24孔板放置在384孔球形磁铁驱动器上，在37℃/ 5% CO下培养₂为期四天，细胞在每个孔内聚集成多个3D球体(图2)。

图2。24孔板孔显示T细胞和生物打印磁化三维靶球体在开始定向激活前的共培养。以10:1的比例加入的T细胞与之前聚集成3D球体的靶细胞。

在球形聚集后，在含有100 ng/mL IL-2 Superkine和250 ng/mL抗cd3和抗cd28抗体的RPMI培养基中以10万细胞/mL的浓度制备T细胞。然后，当培养皿保持在磁铁驱动器上以保持球体时，将废培养基吸出，并替换为先前描述的包含T细胞、抗体和Superkine的新鲜培养基(图2)。然后将培养皿放回安捷伦BioTek BioSpa中孵育6天。2022世界杯附加赛决赛BioSpa再次被预先编程，每隔6小时从每口测试井中捕捉12 × 10的蒙太奇图像。按照一般T细胞激活的解释，在72小时后再次进行人工交换培养基、超因子和抗体。

图像处理与分析

在捕获单个图像块之后，使用表1中的标准在Gen5中应用图像拼接步骤，以创建包含整个井的最终图像。

表1。Brightfield图像拼接参数。

然后使用表2中确定的参数进行定量分析，以确定增殖和细胞聚集的程度。

表2。汇流测量参数。

结果与讨论

一般T细胞激活成像

使用前面描述的设置进行动力学亮场成像，以演示跟踪和量化T细胞激活的能力。

当视觉上比较T细胞激活捕获的图像时，与仅用抗体培养的T细胞相比，用抗体和IL-2 Superkine培养的T细胞在孔中观察到更高水平的细胞增殖(图像中较暗、高度融合的部分增加)和聚集(集中细胞的密集圆形区域)(图3C和4C)。T细胞激活随时间变化的视频可在http://bit.ly/t-cell．这一现象证实了使用IL-2 Superkine可以获得高水平的T细胞激活，以前的文献报道过结果也证实了Cytation 5以无标记的方式监测T细胞激活的能力。

图3。一般T细胞活化、增殖和聚集的亮场成像，10万细胞/孔。4x (A) 0 ng/mL IL-2 Superkine, 144小时;(B) 100 ng/mL IL-2 Superkine, 0小时;(C) 100 ng/mL IL-2 Superkine, 144 h孵育。

图4。一般T细胞活化、增殖和聚集的亮场成像，50万细胞/孔。4x (A) 0 ng/mL IL-2 Superkine, 144小时;(B) 100 ng/mL IL-2 Superkine, 0小时;(C) 100 ng/mL IL-2 Superkine, 144 h孵育。

定量活化也进行了。如图3C和4C所示，高度增殖的细胞聚集在一起，在图像中显示为黑色区域，而背景区域没有细胞。包含这两种条件的像素的亮场信号的差异被用来进行图像分析。通过设置阈值，只包括包含深色增殖聚集细胞的像素，可以创建汇流测量来跟踪T细胞激活。然后将生成的曲线归一化，方法是将在时间0时的初始汇流值减去在后续每个时间点计算的初始汇流值。

图5A的结果是，使用100,000个细胞/孔，在大约96小时的孵育后可以看到明显的汇合变化，测试了最高浓度的IL-2 Superkine，并以一致的方式继续，在144小时或6天孵育后达到峰值。如预期的那样，较低的IL-2 Superkine浓度检测，以及阴性对照，对激活几乎没有影响。

图5。一般T细胞活化的定量。(A) 100,000细胞/孔和(B) 500,000细胞/孔的汇合率变化。由(C) IL-2超级因子浓度的特定三角洲汇流曲线和(D)特定孵育时间点可变超级因子浓度的三角洲汇流值生成的曲线图下的面积。

同样的分析参数也在含有50万个T细胞的孔中进行测试。在同一阱中激活高浓度的T细胞对于某些下游应用是可取的。因此，在这些条件下也能进行正确的汇流测量是至关重要的。在整个潜伏期内，500,000个细胞/孔的汇合度也持续增加(图5B)。然而，与使用10万个细胞/井的96小时相比，融合的增加开始得更早，大约在72小时。此外，阴性对照孔在增殖和细胞聚集方面表现出明显的变化，而在使用较低细胞浓度时则看不到。这两种现象可以归结为较高的T细胞浓度，细胞之间的距离越近，基础活化水平越高。然后，当IL-2超级因子存在时，诱导激活也将在较短的潜伏期后开始。

通过对动能IL-2 Superkine浓度曲线以及特定时间点的可变Superkine浓度进行曲线下面积计算，可以进一步从数据中得出[IL-2 Superkine]和时间的影响。从图5C中可以明显看出，使用50万T细胞/孔，在使用或不使用IL-2 Superkine时，显著的T细胞激活。这两种情况对IL-2 Superkine dize的相对反应似乎相似，但较高的T细胞/孔条件表明，在较高的[IL-2 Superkine]激活大约增加了3倍。最后，图5D中50万和10万细胞/孔的曲线，说明了时间对T细胞增殖和聚集的累积影响，以及在适当的潜伏期内激活T细胞以在下游应用中获得可能的最佳结果的重要性。

定向T细胞激活成像

通过添加特异性抗体和刺激性细胞因子，T细胞达到激活状态，并准备寻找表达抗原的入侵细胞。然而，如果没有预先准备识别特定抗原，免疫反应将是非特异性的，因此效力减弱。在激活过程中，随着特定靶细胞的合并，T细胞不仅被激活，而且被调节来识别靶癌细胞表达的抗原。因此，执行、监测和量化定向T细胞激活的能力是非常可取的。

将T细胞添加到含有生物打印靶细胞球体的24孔板的孔中，进行动态无标签成像。图2显示了在孵育期第0时刻定向激活靶细胞球体和T细胞在每个测试孔中的位置。

从含有250 ng/mL抗cd3和抗cd28抗体和100 ng/mL IL-2 Superkine激活T细胞的孔中捕获的图像，除了MDA-MB-231癌细胞球状体外，与含有非激活T细胞的阴性对照孔相比，再次证明了通过无标签成像监测激活的能力，以及IL-2 Superkine激活T细胞的能力，即使在共培养的靶细胞存在的情况下。

汇流值和面积覆盖的变化图(未显示数据)也证实，当使用共培养细胞模型时，可以量化增殖和细胞聚集。此外，结果表明，定向T细胞激活和一般T细胞激活可以达到同等水平的T细胞激活。

图6。定向T细胞激活、增殖和聚集的亮场成像，10万细胞/孔。4张(A) 100ng /mL IL-2 Superkine +靶细胞，0小时;(B) 0 ng/mL IL-2 Superkine, 144小时;(C) 100 ng/mL IL-2 Superkine加靶细胞，孵育144小时。

结论

通过结合Agilent BioTek BioSpa 8自动培养箱和2022世界杯附加赛决赛Agilent BioTek Cytation 5细胞成像多模式阅读器，动力学成像可用于监测细胞增殖和聚集作为T细胞激活的表型指标。然后使用安捷伦BioTek Gen5微板阅读器和成像仪软件中的图像和细胞分析工具对两种表型进行量化。2022世界杯附加赛决赛通过在激活前添加磁化靶细胞，定向激活也可以很容易地完成。适当的靶细胞和治疗细胞模型、有效的激活鸡尾酒和离场、无标签成像的结合创造了一种理想的方法来监测免疫治疗过程中这关键的第一步。

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