基于图像的人类神经球干细胞模型的分析，用于评估潜在的神经毒物

作者: Brad Larson和Peter Banks, BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT;希拉里·谢尔曼和汉娜·吉齐尔，康宁公司，生命科学肯纳邦克，缅因州;Alexandra Wolff和Wini Luty，恩佐生命科学，法明代尔，纽约州

简介

环境化学品的发育性神经毒性(DNT)是对人类健康的一种威胁，因为发育中的神经系统特别容易受到毒物接触的影响。由此产生的神经缺陷可能会对家庭和社会造成长期的经济和情感影响。目前的DNT测试指南涉及动物模型的使用;主要是啮齿类动物，需要大量的时间和成本非常高;特别是由于需要检测的化学品积压^1、2、3．这一需求，加上目前和未来拟议的关于使用动物试验模型的法规，使得必须找到减少动物试验的新模型，同时提供测试新化学品的适当方法。

将人类神经干细胞(hNSCs)聚合成神经球的三维细胞模型被认为是DNT测试的一种可行替代方法。该体外系统能较准确地反映大脑的增殖、迁移、分化和凋亡等发育过程²．通过包括人类细胞而不是小鼠细胞，该系统也符合建议，以避免体内试验和实际暴露效应之间的物种差异的缺点。

在这里，我们展示了一个由hNSCs组成的三维神经球模型，以进行几种潜在神经毒物的毒性测试。一个专门的球形微板被用来创建和维护三维模型中的细胞。初步验证了三维神经球增殖、多能性和持续分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。神经毒性测试使用神经球保持在三维球体板。在处理过的神经球内评估氧化应激、凋亡和坏死活性的诱导水平，并与阴性对照球进行比较。

材料与方法

材料

细胞

StemPro®神经干细胞(目录编号:A15654)从ThermoFisher(沃尔瑟姆，马萨诸塞州)购买。

盘子

384孔黑色，透明，圆底超低附着球形微板(目录号3830)，384孔高含量成像膜底部微板(目录号4681)和6孔透明，tc处理微板(目录号3516)由康宁生命科学公司(Corning, NY)捐赠。

神经毒物和平板涂料

氯化汞(目录编号215465)、甲基氯化汞(目录编号442534)、过氧化氢溶液(目录编号216763)、聚l -鸟氨酸氢溴化物(目录编号215465)。P3655)和层粘连蛋白(目录编号:L2020)从西格玛-奥尔德里奇(圣路易斯，密苏里州)购买。

培养基和抗体

glutaGRO™DMEM(目录No.10-101-cv)和1%胎牛血清(目录No. 35-010- cv)由康宁生命科学公司获得。neuro基培养基(目录编号:21103-049)、1% N-2补充剂(目录编号:17502-048)、2% B-27补充剂(目录编号:17504-044)和1x谷氨酰胺™(目录编号:35050-061)均来自Life Technologies (Carlsbad, CA)。T3补充(目录编号:T5516)和dcAMP(目录编号D0627)是从Sigma- Aldrich购买的。Nestin(人)单克隆抗体(2C1 3B9)(目录编号;ENZ-ABS109-0100)， Oct4单克隆抗体(9B7)(目录号;ENZ-ABS271-0100)、βIII-Tubulin(人)单克隆抗体(TU-20);ALX- 804-405-C100)， GFAP单克隆抗体(GF2);ENZ-30934)，山羊抗小鼠IgG1 (ATTO 590共轭物)(目录编号: ALX-211- 204TM-C100), and Goat anti-mouse IgG (ATTO 647N conjugate) (Catalog No. ALX-211-205TS-C100) were donated by Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY). Antioligodendrocyte specific protein antibody (Catalog No. ab53041) was purchased from abcam (Cambridge, MA).

分析组件

ROS- id™总ROS检测试剂盒(目录号;ENZ- 51011)， GFP认证的细胞凋亡/坏死检测试剂盒(目录号:ENZ-51002)和NUCLEAR-ID®蓝/红细胞活性试剂(GFP认证)(目录编号:ENZ-53005-C100)由Enzo生命科学公司(Farmingdale, NY)捐赠。Accutase®细胞分离液来自康宁生命科学公司。

细胞成像多模式阅读器

Cytation 5是一种结合自动化数字显微镜的模块化多模式微板阅读器。基于过滤器和单色仪的微板读数可用，显微镜模块提供高达60倍放大的荧光，亮场，彩色亮场和相位对比。该仪器可以在一个步骤中进行多达四个通道的荧光成像。Cytation 5特别强调活细胞分析，温度控制到65°C, CO₂/ O₂气体控制和双喷射器用于动力学分析，并由集成控制Gen5™数据分析软件。该仪器用于成像球体使用亮场和荧光显微镜，以及个别分化细胞镀成二维格式。

方法

星形胶质细胞培养基通过向glutaGRO™DMEM中添加1% N-2补充剂和1%胎牛血清创建。在神经基础培养基中加入2%的B-27补剂、1倍谷氨酰胺和30 ng/mL T3补剂制备少突胶质细胞培养基。神经基础培养基、2% B-27补剂和1x谷氨酰胺联合制备神经元培养基;2天后加入1mM dcAMP。

Neurosphere形成

神经干细胞在6孔板上繁殖，之前涂有聚l -鸟氨酸和层粘连蛋白。然后取出细胞，以32000 -100个细胞/孔的浓度添加到384孔球形微板的孔中，每个浓度重复12次。48小时后形成了单个神经球。含有球状体的孔在细胞学5中成像，之前设置为37°C/5% CO₂使用4倍物镜和亮场成像。

神经球增殖和多能性验证

将Nestin和Oct4特异性一抗分别加入培养的神经球孔中。然后将荧光标记的二抗添加到孔中，以及不含一抗的阴性对照孔中。然后在cyation 5中对井进行成像，之前设置为37°C/5% CO₂使用20倍物镜和RFP和德州红荧光成像通道。

神经干细胞分化

在特定孔中加入50 μL的Accutase分裂神经球。然后将单个神经干细胞添加到聚l -鸟氨酸/层粘胶蛋白包被的384孔高含量显像板的单独孔中，在上述优化的培养基存在下将细胞分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。同时，整个神经球也被转移到含有分化介质的384孔板的孔中。星形胶质细胞孵育4-5天，少突胶质细胞孵育5-6天，神经元孵育7天。在完成规定的分化方案后，再次进行免疫荧光，包括在每个谱系中表达的标记的一级抗体(β iii -微管蛋白:神经元;GFAP:星形胶质细胞;少突胶质细胞特异性蛋白(Oligodendrocyte)和先前描述的二抗。然后在cyation 5中对井进行成像，之前设置为37°C/5% CO₂使用20倍或40倍物镜和RFP, DAPI，德州红荧光成像通道，以及相位对比通道覆盖。

神经毒素的分析

神经干细胞，以2000细胞/孔的浓度，被添加到384孔的球体板上，并允许聚合。然后将得到的神经球暴露在不同浓度的氯化甲基汞、氯化汞和过氧化氢中1、2、4或7天。球体每天都加入新鲜培养基和化合物。孵育后，去除含有化合物的培养基，用新鲜培养基清洗孔，加入含有总ROS、凋亡和活/死细胞探针的培养基4小时。用新鲜介质冲洗孔两次，去除未结合的探针，并在Cytation 5中成像，之前设置为37°C/5% CO₂，使用4倍物镜和DAPI, GFP, RFP和德州红荧光成像通道。

结果与讨论

基于图像的神经球生长跟踪

定期对培养成球状体的复制细胞浓度进行成像(图1)，以确定神经干细胞在三维构型中繁殖的能力，从第0天开始，当球状体形成完成，并在第1、2、4、5和7天再次重复。在cyation 5的亮场成像过程中，集成的Gen5数据分析软件被用来自动在每个球体周围放置物体掩模。

图1所示。三维神经球生长的成像和区域分析。缩略图4x聚合神经球亮场图像。每排12个重复，由分配在32000,16000,8000,4000,2000,1000,500和100个细胞/孔的神经干细胞形成神经球(从上到下)。

图2。在孵育期间，每分配的细胞浓度，与初始面积测量相比，球形面积的平均增长率图。

通过软件计算，12个复制神经球的物体面具内面积的平均增长百分比随时间的变化被绘制出来(图2)。所有神经球在球形板中都显示出活跃的增长，从第0天到第7天的平均增长百分比见证了这一点。与原始值相比，面积增长的百分比从最初包含32,000个细胞的神经球的大约100%到最初包含100个细胞的神经球的超过275%，说明从聚集的细胞数量较低开始的球状体随着时间的推移表现出最高的增殖程度。

神经球增殖和多能性验证

通过Nestin和Oct4荧光探针的免疫荧光进一步检测神经干细胞衍生的神经球保持高增殖和多能能力的能力。Nestin是神经干细胞自我更新所必需的中间丝蛋白，而Oct4是与干细胞多能性相关的转录因子。

3D培养的神经干细胞中Nestin和Oct4增殖蛋白和多效蛋白的表达由图3A和c中一抗和二抗结合发出的荧光信号证实。这些发现进一步得到了验证，在不含一抗的阴性对照孔中没有看到荧光，从而证明只有在结合一抗存在的情况下才会发生二抗体结合。

图3。增殖和多效标记的检测。叠加阳性和阴性对照井的20倍亮场和荧光图像。(A)增殖阳性对照:Nestin(人)单克隆抗体(2C1 3B9) +山羊抗小鼠IgG1 (ATTO 590偶联)抗体。(B)增殖阴性对照:山羊抗小鼠IgG1 (ATTO 590偶联)抗体单用。(C)多能阳性对照:Oct4单克隆抗体(9B7) +山羊抗小鼠IgG (ATTO 647N偶联)抗体。(D)多能阴性对照:单抗山羊抗小鼠IgG (ATTO 647N偶联)抗体。RFP通道:ATTO 590山羊抗小鼠IgG1;德州红通道:ATTO 647山羊抗小鼠IgG。

神经干细胞分化

3D培养的神经干细胞分化为神经元和胶质细胞的能力采用两种不同的方法进行评估。首先，使用Accutase将神经球裂解为单个神经干细胞，然后将其添加到含有特定培养基的成像板的单独孔中。这使得细胞分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。将整个神经球分别转移到含有个别分化介质的成像板孔中。在完成规定的分化方案后，再次进行免疫荧光，包括在每个谱系中表达的标记的初级抗体(β iii -微管蛋白:神经元;GFAP:星形胶质细胞;少突胶质细胞特异性蛋白(Oligodendrocyte)和先前描述的二抗。

图4。2D和3D神经干细胞分化。(A)二维分化神经元和(B)三维神经发生;40 x客观;RFP通道:β iii -微管蛋白1°Ab/ATTO 590 2°Ab;DAPI频道:Hoechst 33342。(C) 2D分化星形胶质细胞，40倍目标;(D) 3D星形发生，20倍目标;德州红通道:GFAP 1°Ab/ATTO 647 2°Ab;DAPI频道:Hoechst 33342。(E) 2D分化少突胶质细胞(F) 3D少突胶质细胞发生;20 x客观; Texas Red Channel: oligodendrocyte specific protein 1° Ab/ ATTO 647 2° Ab; DAPI Channel: Hoechst 33342; Phase contrast channel overlay also shown in (F).

3D培养的神经干细胞在2D格式下分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞(分别见图4A、4C和4E)。当暴露在相同的培养条件下，分化的神经球也可以看到神经、天文和少突胶质发生(分别图4B、4D和4F)。

联合神经球验证实验结果证实，神经干细胞3D培养无不良反应，保持增殖、多能和分化能力，是一种适合神经毒性测试的模型。

神经毒素的分析

最后，我们利用众所周知的神经毒素:甲基氯化汞(MeHgCl)、氯化汞(HgCl)和过氧化氢(H₂O₂)．使用Cytation 5集成的Gen5数据分析软件进行细胞分析，以准确检测从神经球发出的每个探针的信号(图5)。尽管所有其他探针都可能发生变化，但来自活细胞探针的荧光保持一致。因此，用DAPI通道测量的这个阈值信号，被用来自动绘制每个神经球周围的物体掩模(图5A)。设置细胞分析标准，适当增加最小和最大对象大小值，以便将球体注册为单个对象，而不是单个细胞。用GFP、RFP和Texas Red成像通道捕获物体掩膜内的总荧光信号(图5B-G)，然后计算每种化合物处理对3D培养的神经干细胞内氧化应激、凋亡和坏死水平的影响。折叠变化计算公式如下:

RFU_{治疗(时间X)}/ RFU_{未经治疗(时间X)}

在RFU_{治疗(时间X)}为经神经毒物处理的球状体和RFU (_{未处理时间}是孵育1、2、4或7天后来自含有未处理球体的阴性对照井的荧光。

图5的图像说明了与未处理井的信号相比，与已知神经毒物孵卵如何导致荧光探针产生的信号急剧增加。通过结合细胞分析，生成的对象面具只关注每个神经球发出的荧光，消除背景信号，并创建一个高度敏感的测量。然后可以按前面描述的方法计算折叠变化。

图5。基于图像的细胞分析，使用神经毒素处理和荧光探针孵育后的4x图像。(A)使用DAPI通道捕获的处理神经球发出的核id活细胞探针信号周围自动放置的对象掩码。250或0 μM H处理4天后阳性或阴性对照井的荧光信号₂O₂，分别为(B,C)总ROS探针(GFP通道);(D,E)细胞凋亡检测试剂(RFP通道);和(F,G)死细胞探针(德州红通道)。

每个特定化合物在不同化合物培养时间下的测试井信号除以未处理井的平均值，以计算折叠变化(图6)。

图6。测试复合神经毒性效应计算。结果显示(A)总ROS;(B)细胞凋亡;(C)坏死。

根据图6A的结果，虽然在培养的第7天，每种化合物都会引起神经球氧化应激的最终增加，但氯化甲基汞显示出最大和最早的影响，在第2天达到峰值。相比之下，氯化汞处理只导致总ROS检测试剂盒信号的峰值倍变化，比氯化甲基汞低4倍，比过氧化氢低2倍。

通过检查凋亡试剂产生的数据(图6B)，可以看到，由每个测试分子引起的氧化应激导致同一球内细胞的凋亡活性最终增加。最大的凋亡诱导在孵育4天后达到峰值，与各种神经毒物孵育后的结果相似。在第7天，来自检测试剂的信号减弱，很可能是由于此时细胞大部分已经坏死。坏死试剂的结果证实了这一点(图6C)。这种荧光探针产生的信号的折叠变化随着每种神经毒物与神经球孵育的时间的增加而增加，在第7天达到峰值。

结论

我们已经证明，使用康宁384孔球形微板将神经干细胞培养成3D神经球，代表了一个可行的、健壮的细胞模型，很容易创建和可复制。高效的微板配置允许简单的介质更换，复合给药和分析性能，同时也允许细胞成像，而无需转移到单独的板。来自Enzo生命科学公司的一抗，针对独特的目标，当与荧光标记的二抗合作时，提供了一种敏感的方法来评估培养神经球中必需蛋白质的存在。此外，荧光探针，也来自Enzo生命科学，提供了一种快速和容易识别的方法，以检测重要的有毒生物标志物的变化。Cytation™5细胞成像多模式阅读器是一种敏感而灵活的系统，当使用宽放大范围对2D神经干细胞和3D神经球进行亮场、相位对比和荧光成像时。集成的Gen5™数据分析软件实时准确地检测和分析多个完整球体的变化。最后，3D细胞模型和微板、评估方法和仪器设备的结合创造了一个强大的解决方案，可以对测试分子的潜在神经毒性影响进行精确、高通量的评估。

参考文献

1. 美国环境保护署。神经毒性风险评估指南。华盛顿特区，国家学院出版社，1998年。
2. 经济合作与发展组织。经合组织化学品测试准则第4节:健康影响。巴黎,法国。经合组织iLibrary。2007.
3. Lein p;Silbergeld大肠;洛克,p;戈德堡,点发育神经毒性测试(DNT)的体外和其他替代方法。环境毒理学与药理学，2005,19(3)，735-744。
4. Salama m;Lotfy, a;Fathy k;苏格兰诗人,m;El-emam m;El-gamal, a;El-gamal m;Badawy, a;穆罕默德,W.M.Y.;马拉硫磷对三维神经球系统的发育性神经毒性作用。 Applied & Translational Genomics. 2015, 7, 13-18.

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