星形胶质细胞和单核细胞共培养模型中炎症细胞因子的高通量、多重检测

作者: Brad Larson, BioTek Instruments, Inc.， Winooski, VT美国;罗杰·博斯PerkinElmer，沃尔瑟姆，美国MA;Tracee Crossett,龙沙集团有限公司，瑞士巴塞尔

简介

据报道，炎症细胞因子水平在多种神经退行性疾病中显著升高，包括阿尔茨海默病(AD)和多发性硬化症¹．星形胶质细胞是IL-6的重要来源，而神经胶质细胞是IL-1和tnf - α的重要生产者²．研究还表明，在特定条件下，星形胶质细胞和神经元可以表达多种不同的细胞因子，而这些细胞因子通常是检测不到的。这三种细胞类型，胶质细胞，星形胶质细胞和神经元，通常相互作用产生炎症反应。例如，在AD中，活化的星形胶质细胞和小胶质细胞在神经元和斑块附近大量存在^3.．因此，必须在分离和共培养模型中对相关细胞类型进行相关细胞因子水平的评估。

以前，细胞因子水平是通过测定个体蛋白质浓度的方法来评估的。由于细胞因子被分泌到周围的培养基中，从一个单孔进行多次分析。该过程是劳动密集型的，在单独的井中进行单独的评估可能会增加集体数据集的可变性。通过结合一种能够在同一井中评估多种细胞因子的检测技术，可以消除可变性，从而创建一个健壮的检测方法。

在这里，我们描述了一种均匀的、基于珠的免疫分析技术，该技术提供了在单孔中多种细胞因子的多重检测。被链霉亲和素包被的供体珠与生物素化抗体结合，特异性针对被评估的目标分析物之一。受体珠，在激发时提供不同的发射轮廓，也直接偶联到一个特定的抗分析抗体。在单个分析物存在的情况下，珠子彼此靠近。当在新型高通量多模微板阅读器上使用680 nm激光激发时，供体微珠将溶解氧转化为单线态氧分子，导致受体微珠中的能量转移级联，并在适当波长下增加光发射。因此，高信号值表明井内细胞因子释放量较大。低温保存的原代星形胶质细胞和外周血CD14+单核细胞被独立合并，并在共培养中，以增加生成结果的相关性。复合检测技术、细胞模型和基于激光的检测相结合，提供了一种快速、高灵敏度的方法来评估重要的炎症细胞因子水平。

测定原理

AlphaPlex™是一种均质、一孔多路复用试剂技术，可对从大蛋白到小分子和稀缺生物样品(如原代细胞和干细胞)的广泛分析物提供高度灵敏的检测。该协议是基于Alpha技术的一种简单的nowash检测格式。通过使用多个发射不同波长的受体珠(AlphaLISA Europium (Eu):615 nm;AlphaPlex铽(Tb):545 nm;AlphaPlex钐(Sm):645 nm)，可同时检测多种分析物。

图1所示。AlphaPlex检测原理。生物素化抗分析抗体结合到链霉亲和素包被的α供体珠上，而其他抗分析抗体直接结合到AlphaLISA, AlphaPlex 545或AlphaPlex 645受体珠上。在特定分析物存在的情况下，珠子接近。

材料与方法

材料

分析和实验成分

AlphaPlex 545 (Tb) IL-6检测试剂盒(目录号;AP223TB-C)， AlphaPlex 645 (Sm)人il - 1β检测试剂盒(目录编号:AP220SM-C)和人TNFα免疫分析试剂盒(目录编号:AP220SM-C);AL208C)是由PerkinElmer (Waltham, MA)捐赠的。大肠杆菌055:B5的脂多糖(LPS)(目录编号:055;L2880)和人类干扰素-γ (hIFNγ)(目录编号11040596001)从西格玛-奥尔德里奇(圣路易斯，密苏里州)购买。

细胞

超低温保存的正常人星形胶质细胞。CC-2565)、AGM™Bullet Kit™(CC-3186)包含基础培养基和支持星形胶质细胞培养的补剂，以及低温保存的外周血CD14+单核细胞(2W-400C)由Lonza Group, Ltd (Basel, Switzerland)捐赠。

Synergy™Neo2多模式阅读器

Synergy Neo2 Multi-Mode Reader结合BioTek的专利混合技术™，旨在实现速度和超高性能。独立的光路可以满足不同的检测要求，具有可变带宽的四重单色仪，敏感的基于滤波器的光学，基于激光的Alpha检测激励和高达4个pmt的超快测量。集成的Gen5™数据分析软件控制Synergy Neo2。先进的环境控制，包括CO2 /O2控制，培养到65°C和可变振动是活细胞检测的理想选择，基于细胞的检测通过直接底部照明进行优化。条形码标记的过滤器立方体有助于简化工作流程和限制错误。

Cytation™5细胞成像多模式阅读器

Cytation 5是一种结合自动化数字显微镜的模块化多模式微板阅读器。基于滤镜和单色仪的微板读数可用，显微镜模块提供高达60倍放大的荧光，亮场，彩色亮场和相位对比。集成的Gen5™数据分析软件控制细胞增殖该仪器用于捕获细胞培养和共培养的亮场图像。

方法

细胞板

冷冻保存的星形胶质细胞被解冻并添加到96孔板，使用供应商的推荐，浓度为1.5x10⁴细胞/厘米²体积为100 μL。对于0.32厘米²每孔共加入5000个细胞，在37ºC/5% CO条件下培养₂72小时。24小时后进行媒体交换，此后每48小时进行一次。星形胶质细胞加倍时间预定为约24小时，72小时后产生约40000个细胞/孔。取去培养基，在星形胶质细胞完整培养基中加入等量的单核细胞，加入空孔或含有星形胶质细胞的孔，体积为50 μL。将培养基添加到其他含有星形胶质细胞的孔中。最终，孔中要么含有星形胶质细胞，要么含有单核细胞，要么含有共培养物。

LPS+ IFNy添加

将LPS和IFNγ稀释到培养基中，在恒定的300 U/mL IFNγ浓度下，产生2000-0 ng/ mL的2X LPS浓度。将50微升滴定液添加到包含每个细胞模型的指定孔中。

AlphaPlex检测性能

在孵育8、24和48小时后，从每个孔中取出5微升的等分液，用于使用AlphaPlex Tb IL-6/AlphaLISA TNFα或AlphaPlex Sm IL-1β/AlphaLISA TNFα双工分析。然后进行基于激光的微板读数，以检测和量化每个孔的分泌细胞因子水平。Gen5数据分析软件协议包括使用通用Alpha激发和Tb/Eu发射立方体对铽和铕信号进行初始同步读取。然后将Tb/Eu立方体替换为Sm发射立方体完成协议。

结果与讨论

双工分析信号优化

在进行基于细胞的AlphaPlex检测之前，对读取器设置和检测成分浓度进行了优化，以限制多重检测过程中的信号交叉。窄滤波器带宽(表1)被用来最小化从每次读取的不需要的信号捕获。然后测试可变受体珠浓度以进一步减少串扰。

如图2所示，我们创建了两个双工图，以展示结合和有效检测多重Tb/Eu和Sm/Eu检测信号的能力。在测试中，起始浓度为25 μg/mL的Tb将串扰最小化到1.8%的可接受水平，而2.5 μg/mL的Eu AlphaLISA珠则需要将串扰最小化到相同水平(1%)(图2A)。同样的Eu珠浓度也能在Sm通道中产生最小的串扰(0.85%)，而2.5 μg/mL的Sm珠浓度也需要最小化Eu通道中的串扰(1.95%)(图2B)。

表1。使用Synergy Neo2优化AlphaPlex读取的过滤器和镜像。

图2。信号串扰百分比显示(A) Eu/Tb双工分析和(B) Eu/Sm双工分析优化使用阅读器设置和协议。

建立完整的分析物标准曲线，用检测受体珠浓度为25 μg/ mL Tb:IL-6进行检测;2.5 μg/mL Eu:TNFα;2.5 μg/mL Sm:IL-1β。使用两个读取器通道捕获信号进行多重检测(IL-6和TNFα或IL-1β和TNFα)。图3显示了宽大的分析窗口和精确的标准曲线可以通过优化设置有效地减少串扰。

图3。分析物标准曲线检测使用目标和双工分析读取器通道。(A)使用Tb和Eu通道读取IL-6 Tb检测;(B)使用Eu和Tb通道读取TNFα Eu试验;(C)使用Sm和Eu通道读取IL-1β Sm;(D)使用Eu和Sm通道读取TNFα Eu实验。

最终双工分析验证

然后比较添加到含有单一或双分析受体珠的分析孔中的分析物滴定，以评估在多重设置中检测质量是否受到影响。分析物浓度范围为100000 - 0pg /mL，仅在目标分析受体珠或双分析受体珠存在的情况下进行分析。

根据图4，从单或双分析格式运行的分析物标准曲线的α信号和曲线形状的相似性验证了在检测孔中添加第二组受体珠对检测质量没有负面影响的发现。

图4。单、双分析分析物标准曲线。(A) IL-6 + IL-6 Tb受体珠，或+ IL-6 Tb受体珠和tnf - α Eu受体珠;(B)只有tnf - α + tnf - α Eu受体珠，或加tnf - α Eu受体珠和IL-6 Tb受体珠;(C) IL-1β + IL-1β Sm受体珠，或+ IL-1β Sm受体珠和TNFα Eu受体珠;(D)只有tnf - α + tnf - α Eu受体珠，或加上tnf - α Eu受体珠和IL-1β Sm受体珠。

最后，将hTNFα分析物标准曲线的信号与TNFα Eu测定法和IL-6 Tb或IL-1β Sm测定法的信号进行比较。图5绘制的曲线表明，当AlphaLISA试验与铽或钐AlphaPlex试验进行复用时，可以获得相同的结果。

图5．hTNFα分析物滴定是在TNFα Eu受体珠与IL-6 Tb或IL-1β Sm受体珠双重存在的情况下进行的。

炎症细胞因子检测

在优化和验证了这两种多重检测方法后，我们使用了一种基于细胞的实验来检测胶质细胞和单个核细胞的炎症细胞因子分泌。冷冻保存的原代星形胶质细胞和单核细胞被单独添加到孔中(图6A和B)，或如前所述在共培养(图6C)中添加。图6中的图像表明，这两种细胞类型可以在一个单孔中成功共培养，从而用于后续的测试。然后将不同浓度的已知刺激物LPS与IFNγ结合添加到井中。每隔一定时间从上清中取出等分，并使用IL-6 Tb AlphaPlex/TNFα AlphaLISA或IL-1β Sm AlphaPlex/TNFα AlphaLISA双相分析，以监测基础和刺激细胞条件下细胞因子分泌的潜在变化。

图6．胶质细胞和单核细胞培养。20x亮场图像显示(A)星形胶质细胞;(B)单核细胞;或(C) 96孔式共培养细胞。

接下来，使用Graph Pad Prism V. 5.01根据纯化的分析物标准曲线，通过插值未知样品的Alpha信号来测定IL-6 pg/mL浓度。当检查图7A-C中的图表时，很明显，LPS和IFNγ的组合刺激了所有测试的细胞模型的IL-6分泌。此外，细胞因子的分泌有时间和浓度依赖性。图7D还表明，联合培养的星形胶质细胞和单核细胞保持一致的IL-6分泌，与独立细胞培养相比，联合培养时产生的细胞因子浓度按比例更高。这与先前发表的使用星形细胞和单核细胞细胞系的发现一致⁴．

图7。从星形胶质细胞和单核细胞培养物和共培养物中分泌IL-6。LPS和IFNγ刺激(A)星形胶质细胞8、24和48小时后，培养基中分泌pg/mL IL-6浓度;(B)单核细胞;或(C)共培养细胞。(D)在基础和刺激条件下，每个细胞模型培养基中IL-6浓度的48小时时间点。

在与LPS和IFNγ孵育48小时后(图8A)，只有星形胶质细胞的孔中TNFα分泌水平变化不大。浓度如前所述被插值。相比之下，在含有单核细胞或共培养细胞的孔中可以看到刺激，峰值为1 ng/mL LPS。然而，浓度没有变化从单核细胞孔，表明分泌是由于单核细胞在共培养。这些发现与之前的文献报道的LPS刺激的小胶质细胞比星形胶质细胞产生更高的TNFα相同⁵．IL- 1β遵循类似的模式(图8B)，与星形胶质细胞相比，单核细胞分泌的细胞因子水平更高。有趣的是，IL-1β分泌在共培养的细胞模型中以剂量依赖性的方式减少，表明两种细胞类型之间对特定炎症途径有潜在的抑制作用，再次与文献一致⁴．这就强调了在实验过程中使用正确的细胞模型的重要性。

图8。48小时LPS/IFNγ刺激TNFα和IL-1β细胞因子分泌。分泌浓度(A) TNFα;或(B)在LPS/IFNγ刺激48小时后，从星形胶质细胞、单核细胞或共培养细胞中提取IL-1β。

结论

我们已经证明，来自PerkinElmer的AlphaPlex分析是一种简单、灵敏、均匀和高通量的方法，可以监测来自同一化验井的双相分析物的分泌。与此同时，合并龙沙的低温保存原代细胞简化了基于细胞的分析过程。Synergy Neo2多模微板阅读器，具有基于激光的激发和双PMT能力，然后允许高密度，多路AlphaPlex分析轻松执行与单一协议。

使用适当的原代细胞模型可以确保体外分析物的表达与在体内观察到的表达非常相似，而不是使用癌细胞系替代品，如Oh等人，1999年的工作所见⁶．星形胶质细胞与单核细胞共培养，也会影响细胞因子产生的程度和速率等实验因素。最后，复合分析方法、细胞模型和微板阅读器的结合创建了强大的体外方法，可以轻松和准确地测量炎症细胞因子分泌物。

参考文献

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